酪蛋白磷酸肽的酶水解條件研究

軒詩海1 張鐵濤2

（1 黑龍江省完達山乳業股份有限公司 2 瓊州學院化學系）

近年來，生物活性肽作為保健食品市場的新生力量顯示出了強大的市場潛力。乳源性生物活性肽是生物活性肽中最重要的一類，乳源性生物活性肽的種類繁多，目前已發現的有阿片肽、免疫促進肽、阿片拮抗肽、抗高血壓肽、抗血栓肽、酪蛋白磷酸肽和其它一些生物活性肽［1,2］，其中酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPPs）是發現較早的一種，酪蛋白磷酸肽是蛋白酶水解酪蛋白后形成的一種含成簇磷酸絲氨酸基團的生物活性短肽，因其具有促進礦物質吸收，特別是鈣質吸收等多種生物活性而倍受關注。本研究主要是以粗制的干酪素為原料，采用四因素三水平L9（34）正交試驗，確定堿性蛋白酶水解干酪素制備酪蛋白磷酸肽的最佳工藝條件［3,4,5］。

1 材料與方法

1.1 原料與主要試劑

本試驗所用的原料是甘肅華羚乳品集團公司工業精一級干酪素，顏色呈淡黃色，其主要成分見表1-1，其它化學試劑均為分析純。

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1.2 堿性蛋白酶水解干酪素制備CPPs單因素試驗

為了確定正交試驗各因素的水平范圍，以水解度為指標，對影響蛋白酶水解的[E]/[S]、pH、溫度和時間做單因素分析。

1.2.1 [E]/[S]對水解度影響

固定底物濃度為15%，pH為9.0，溫度為50℃，水解時間為2.0 h。選取[E]/[S]為 400 u/g～2000 u/g（相差為400 u/g），對底物進行水解。

1.2.2 pH對水解度影響

固定底物濃度為15%，[E]/[S]為800 u/g，溫度為50℃，水解時間為2.0 h。選取pH為9.0～11.0（相差為0.5），對底物進行水解。

1.2.3 溫度對水解度的影響

固定底物濃度為15%，[E]/[S]為800 u/g，pH為9.0，水解時間為2.0 h。選取溫度為40℃～60℃（相差為5℃），對底物進行水解。

1.2.4 水解時間對水解度的影響

固定底物濃度為15%，[E]/[S]為800 u/g，pH為9.0，溫度為50℃。選取水解時間為1.0 h～3.0 h（相差為0.5 h），對底物進行水解。

1.3 最佳水解條件的選擇

根據單因素試驗，固定底物濃度為15%，按表1-2設計四因素三水平正交實驗方案，在不同[E]/[S]、水解溫度、反應pH和水解時間的條件下對底物進行水解，根據CPPs的N/P來確定最佳水解條件。到達預定反應時間后，立即將反應器置于沸水浴中5 min，以終止水解反應。

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2 結果與討論

2.1 堿性蛋白酶水解干酪素制備CPPs單因素實驗分析

2.1.1 [E]/[S]對水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、溫度50℃、pH 9.0、時間2.0 h，[E]/[S]分別為400 u/g、800 u/g、1200 u/g、1600 u/g、2000 u/g。以不同[E]/[S]為橫坐標，所消耗的0.1mol/LNaOH的體積為縱坐標繪制曲線，見圖2-1。

從圖2-1看出，隨著[E]/[S]的升高，水解度也不斷增大，但是當酶濃度達到一定的數值時，水解度不再升高，而是趨于平緩，也就是說底物與酶的結合位點已達到飽和，即使增加酶量也沒有底物與之結合。

2.1.2 pH對水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、[E]/[S]800 u/g、溫度50℃、時間2.0 h，pH分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。以pH為橫坐標，所消耗的0.1mol/LNaOH的體積為縱坐標繪制曲線，見圖2-2。

從圖2-2看出，pH小于10時，水解度隨pH增大而不斷增大，pH大于10時，水解度隨pH增大而不斷減少，在pH等于10，水解度最大，說明其最適pH為10。

2.1.3 溫度對水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、[E]/[S]800u/g、pH 9.0、時間2.0 h，水解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。以水解溫度為橫坐標，所消耗的0.1mol/LNaOH的體積為縱坐標繪制曲線，見圖2-3。

從圖2-3看出，隨著水解溫度的升高，水解度也增加，當溫度達到55℃時，水解度不再升高并趨于平緩，也就是說將反應溫度維持在55℃～60℃，酶活力能保持最高值。

2.1.4 時間對水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、[E]/[S]800u/g、溫度50℃、pH 9.0，水解時間分別為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h。以水解時間為橫坐標，所消耗NaOH的體積為縱坐標繪制曲線，見圖2-4。

從圖2-4可看出，隨著水解時間的增加，水解度持續增加，當水解2.5 h后，水解度不再升高并趨于平緩，這時候酶對蛋白質的水解減緩，酶活力下降，這時應終止水解反應。

從單因素的實驗中我們可以看出，對堿性蛋白酶來說，最有利于它進行水解的條件為[E]/[S]為1200 u/g、pH 10、溫度55℃、水解時間為2.5 h。

2.2 堿性蛋白酶制備CPPs最佳條件的確定

做為CPPs產品優劣的評定指標，N/P摩爾比比較客觀地反映出磷酸絲氨酸基團在多肽中的密度，其值越小，磷酸絲氨酸基團的密度越大，肽鏈越短，產品純度越高，其結合礦物質離子的能力就越強。以N/P值為指標，用四因素三水平的正交實驗確定其最佳水解條件，試驗結果見表2-1，結果分析見表2-1。

從表2-1可以看出各因素對N/P摩爾比影響的大小順序為：B>D>A>C。最終確定水解條件的最優組合為A3B1C3D1，即最佳反應條件為：溫度55℃、pH9.0、時間2.5h、酶濃度800u/g。經驗證性試驗得出，在此條件下得到的CPPs的N/P比為4.371，產率為12.88%。

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3 結論

由單因素實驗分析結果及四因素三水平L9（34）正交試驗，確定用堿性蛋白酶從水解的原料—劣質干酪素中提取酪蛋白的最佳反應條件是溫度55℃、pH 9.0、時間4.0 h、原料濃度為15%。由方差分析可知，選定的四個因素在其相應的水平范圍內對試驗的影響都不太大，因此在原則上，試驗進行時這四個因素只需控制在其相應的水平范圍內即可。

[1] 蔡為榮, 薛正蓮.生物活性肽－酪蛋白磷酸肽（CPP）的研制[J].食品科學, 2001, 22(4):52～54

[2] 馮杰龍, 林煒鐵, 徐曉飛, 姚汝華.生物活性肽及其蛋白酶水解法制備探索[J].廣州食品工業科技, 2002, 18(3):36～38

[3] 陳慶森, 龐廣昌, 林康藝, 胡志和, 劉劍虹, 閻亞麗.固定化堿性蛋白酶生產CPP的研究[J].食品科學, 2000, 21(1):25～28

[4] 劉劍虹, 龐廣昌, 于金華, 張曉玲, 陳慶森, 胡志和.酪蛋白磷酸肽(CPPs)的純化研究[J].食品科學, 2001, 22(4):31～35

[5] 龐廣昌, 胡志和, 陳慶森, 劉劍虹.利用2709堿性蛋白酶水解酪蛋白制備CPPs的研究[J].食品科學, 2000,21(12):34～35