酶解輔助乙醇法提取土茯苓總黃酮條件研究

任倩 李志平* 楊朝霞 朱曉妮

（吉首大學化學化工學院 湖南吉首 416000）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，主要產于華中、華南地區。味甘、淡，性平，具有解毒散結、祛風通絡、利濕泄濁的作用，主治喉痹、癰疽惡瘡、瘰癘、癌瘤、筋骨攣痛、水腫、淋濁、泄瀉、腳氣、濕疹疥癬、汞中毒。土茯苓含有多糖類、有機酸類、苯丙素類、黃酮及黃酮苷類、甾醇類、皂苷類及揮發油等多種化學成分。其中具有很強的抗氧化和消除自由基作用的類黃酮受到空前的重視[1~5]。

纖維素酶解輔助提取黃酮是較新的方法。湘西地區盛產土茯苓，本文擬采用植物纖維素酶解輔助乙醇法，對土茯苓中總黃酮的提取條件進行研究，為湘西地區土茯苓的開發利用提供理論和實踐依據。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

TC-15套式恒溫箱（海寧市新華醫療器械廠）；DHG-924A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精密試驗設備有限公司）；TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）；AY220型托盤電子分析天平（島津）；電子天平（中國凱豐集團）；HH S21-4--S電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）；PHS-4A實驗室PH計；SHB-3循環真空泵（上海申生科技有限公司）；SENCOR系列旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）。

1.1.2 實驗試劑

土茯苓（湖南省吉首市某藥廠提供），YZ7-601植物提取復合酶（湖南尤特爾生化有限公司），95%乙醇（湖南匯虹試劑有限公司），蘆丁標準品（不小于98.0%，中國藥品生物制品檢定所）；硝酸鈉、氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司）、硝酸鋁（天津市大茂化學試劑廠）（均為分析純，不需處理直接使用）；去離子水。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品21.5 mg，用30%的乙醇溶解完全后，移入100mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，即得蘆丁標準溶液。分別精密吸取上述蘆丁標準液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、16.0、32.0mL于50mL容量瓶中，按徐雅琴等人的方法顯色測定[6,7]，用紫外-可見光分光光度計測定510nm處吸光度。

以蘆丁濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸，得回歸曲線方程y=9.2283x+0.0139，R2=0.9987。

1.2.2 土茯苓總黃酮的提取方法

將采集的土茯苓自然曬干，用切片機切片，切片自然曬干，得土茯苓干片，備用。

準確稱取一定質量的土茯苓干片，置于三角燒瓶中，加入一定體積的乙醇和一定質量的植物植物復合酶，調節水溶液pH值為一定值，在48℃水浴鍋中恒溫加熱，酶解一定時間，加入70%乙醇200mL，水浴鍋升溫至88℃，恒溫滅酶10min。冷卻，改為回流裝置，水浴加熱回流2h，提取液冷卻、過濾，濾液定容。取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見分光光度法測定總黃酮濃度，計算總黃酮提取率。

1.2.3 土茯苓總黃酮測定方法

總黃酮提取液于250mL容量瓶中加入70%乙醇定容，搖勻。取2.0mL定容液于25mL容量瓶中，按徐雅琴等人的方法配置顯色溶液，用紫外-可見分光光度計測定其510.0nm處的吸光度，根據標準曲線回歸方程計算提取液總黃酮濃度，并按以下公式計算總黃酮提取率。

總黃酮提取率（%）=樣品中總黃酮質量/樣品質量×100%

提取液用旋轉蒸發儀蒸發濃縮至粘稠狀，粘稠物轉移至蒸發皿，放入真空恒溫干燥箱中一定溫度和壓力下恒溫干燥至恒重，粉碎得棕黃色粉末，即為土茯苓粗提物干粉，稱量。分別按下述公式計算干粉得率和干粉中總黃酮含量。

干粉得率(%) =干粉質量/樣品質量 × 100%

干粉總黃酮含量(%) =干粉中總黃酮質量 / 干粉質量 × 100%

1.2.4 最佳提取條件實驗方法

對影響總黃酮提取率的主要因素酶添加量、酶解時間、pH值等3個因素進行單因素實驗，探討最佳提取條件，最佳提取條件通過重復實驗加以驗證[8~10]。

1.2.4.1 酶添加量對總黃酮提取率影響

準確稱取土茯苓干片6份，各30.0g，分別加入具塞錐形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再加入不同質量的植物復合酶，使酶濃度為0%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、3.0%，控制溫度48℃，調節酶解介質pH為4.8，酶解3.0h后，置于水浴鍋內升至88℃，保持恒溫滅酶10min。加入200mL、70%的乙醇，回流2h，減壓抽濾，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見光分光光度計測定總黃酮濃度，計算總黃酮提取率。考察酶添加量對土茯苓總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 酶解時間對總黃酮提取率影響

準確稱取土茯苓干片6份，各30.0g，分別加入具塞錐形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再按土茯苓干片質量各加入1.0%的植物復合酶，調節酶解介質pH為4.8，置于48℃水浴鍋中，分別酶解0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h，酶解液升至88℃，保持恒溫滅酶10min。加入200mL、70%乙醇，回流2h，減壓抽濾，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見分光光度法測定總黃酮濃度，計算總黃酮提取率。考察酶解時間對土茯苓總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 pH值對總黃酮提取率影響

準確稱取土茯苓干片6份，各30.0g，分別加入具塞錐形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再按土茯苓干片質量各加入1.0%的植物復合酶，酶解時間為3h，置于48℃水浴鍋中，分別調節酶解介質pH為4.0、4.5、4.5、5.0、6.0，水浴鍋內升至88℃，保持恒溫滅酶10min。加入200mL、70%的乙醇，回流2h，減壓抽濾，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，取一定體積定溶液，用鋁離子顯色、紫外-可見分光光度法測定總黃酮濃度，計算總黃酮提取率。考察pH值對土茯苓總黃酮提取率的影響。

2 結果與討論

2.1 植物復合酶酶解條件單因素實驗結果

2.1.1 酶濃度對總黃酮提取率影響

酶添加量對土茯苓總黃酮提取率的影響結果見圖1。

從圖1可以看出，酶的含量超過一定范圍時，黃酮類物質的提取率反而下降，在1.0%時總黃酮得率達到最大值，繼續增大酶濃度，總黃酮得率反而逐漸下降，原因有待進一步研究。

2.1.2 酶解時間對土茯苓黃酮提取率影響

酶解時間對土茯苓總黃酮提取率的影響結果見圖2。

從圖2可以看出，酶解時間增加，總黃酮提取率逐步增加達到一定值后逐漸趨于不變，當酶解時間達到2.0h時黃酮的提取率趨于不變。

2.1.3 pH值對土茯苓黃酮提取結果影響

PH值對土茯苓總黃酮提取率的影響結果見圖3。

由圖3可以看出：在介質pH為4.5到5.0，總黃酮得率增加，在pH=5.0時達到最高，當pH為5.5時總黃酮提取率降低。其原因可能是酶活性受介質pH的影響，pH值不僅影響酶的構象，而且也影響底物的解離狀態。

2.2 最佳提取條件重復實驗

由單因素實驗得出酶解輔助法提取土茯苓總黃酮的最佳提取條件為：酶添加量1.0%，酶解時間3.0h，pH值5.0。

最佳提取條件進行3次重復實驗結果見表1：

實驗結果表明，單因素實驗中各影響因素的最佳條件組合重現性良好。最佳條件下，粗提物干粉得率13.9%，干粉中總黃酮含量4.0%，總黃酮提取率為0.53 %。

3 結論

酶解輔助乙醇法提取土茯苓總黃酮的最佳條件為：酶濃度1.0%，酶解時間3.0h，酶解介質pH為5.0；最佳條件下，粗提物干粉得率13.9%，干粉中總黃酮含量4.0%，總黃酮提取率為0.53 %。

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