高效液相色譜泵出口單向閥功能的新性能測試

Eduard ROGATSKY, Matthew GALLITTO, Daniel T.STEIN

單向閥對于高效液相色譜(HPLC)泵硬件來說是一個重要的機械部件。在參考文獻[1]中對單向閥的功能和硬件設計進行了詳細描述。簡單來說，就是一對單向閥(入口和出口)阻止流體在HPLC泵頭里從高壓區流向低壓區，從而泵的活塞在高壓下使流動相通過色譜柱。“一個功能適宜的單向閥必須能夠快速方便地打開和關閉，同時還要確保密閉性在一個寬的壓力值范圍內均有效[1]”。

根據定義，HPLC泵上的單向閥是在高壓下承受重復的機械壓力，因此這個設備比HPLC泵的其他部件(例如活塞或活塞密封圈)更易出現故障。但在單向閥出現故障時卻很難識別，雖然HPLC可以通過泵壓力下降準確地檢測不同種類的外部泄漏，然而遺憾的是泵內部連接的漏液卻是比較復雜的，因為此時不會有一個明顯的壓力下降，所以HPLC軟件程序中的診斷算法也無法識別。

已有人在運行高通量的多維液相色譜時發現了這個問題[2]。他們觀察到在這個應用程序中，被分析物的保留時間非常慢但是平穩增加大約10%；然而硬件診斷測試卻能成功通過。這種現象不能解釋為色譜柱的損壞，而且正如所預料的那樣換色譜柱是無益的。這個問題需要通過替換安捷倫1100二元HPLC泵(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)B泵頭(提供有機溶劑)上的出口單向閥才能解決。值得注意的是，替換A泵頭的單向閥不會影響保留時間(數據沒有列出)。

Agilent 1100系列二元泵G1312A由兩個一模一樣的溶劑傳輸通道(泵頭)組成。每個泵頭使用兩個活塞來輸送溶劑，即入口和出口單向閥(圖1)。為了找出可能的泵故障，壓力測試(PT)和漏液測試(LT)可作為ChemStation軟件(Agilent)的一部分。壓力測試僅使用A通道使壓力增加到390 bar，然后泵流速關閉。預期的壓降應該不超過2 bar/min。這種測試能有效地評估外部泄漏；然而內部泄漏可能仍舊存在并且很難發現。例如，對12個已使用過的出口單向閥進行試驗研究，其中一些雖能成功通過壓力測試，但是不能通過漏液測試，漏液測試對內泄漏評估更有效。在這個測試中，每個活塞以3 μL/min速度傳輸30 s，所得到的壓力曲線應是水平的(穩定水平)或是極小正數，換句話說，如果壓力出現負的斜率，測試就失敗了，意味著所輸送的異丙醇100%的損失。壓力曲線是水平的而不是降低的內漏是ChemStation診斷方法/算法認為可接受的內漏。當溶劑傳輸時在活塞1的沖擊下通過一個發生故障的入口單向閥部分回流到溶液存儲器中，此時就會發生內漏。或者，溶液在活塞2的沖擊下通過發生故障的出口單向閥部分回流到室1。當活塞2傳輸溶劑時，充滿大氣壓的室1會發生從高壓到低壓的回流。內漏影響泵頭傳輸的實際流速，它比軟件預調的值少。流量計可以測出泵流量，理論上，在安裝流速限制器(例如毛細管) 之后，精確流量計可以檢測出微小的內泄露。然而，一個液體流量計價格昂貴，且很難保證同步性，在分析實驗室里很少使用。因此檢測內泄漏極具挑戰性。

如上所述，增加的保留時間可以用來解釋流動相在泵頭B(傳輸有機相)的內泄漏。這樣的泄漏從傳輸泵頭室2到計量泵頭室1都可能發生。如果出口單向閥的球座壞了也可能發生回流。因此越少的有機溶劑通過泵傳輸到色譜柱，保留時間就越長。保留時間增加的另外一種可能是通過一個沒有完全關閉的入口單向閥從室1漏液。理論上，如果泵頭A的機械耐用性比泵頭B高(導致更多的內漏)，這樣的循環將會減少被分析物的保留時間。這種漂移，可能會錯誤的解釋為是色譜柱損壞造成的結果。

一般的HPLC診斷測試無法診斷出微量的內漏液，所以研發出一系列的性能測試，以期設計出解決潛在的單向閥溶液傳輸問題故障的方法。實驗是在Agilent 1100系列二元泵G1312A和紫外檢測器G1314A上完成的。

我們建議以下的方法。在泵維護或修理后，在相同流量下，使用水作為流動相A和水/0.1%丙酮作為流動相B運行30 min的梯度，更換一根色譜柱，安裝上背壓閥。作者使用1.5 mX65 μm i.d.的PEEK管(p#1560,IDEX/Upchurch, Oak Harbor, WA)作為一個零死體積的流量限制器，這種管子在0.5 mL/min時產生250 bar的壓力。然后，達到最大吸收信號一半時的保留時間可以通過254 nm波長的紫外曲線計算出來[3]。通過減去梯度前的平衡時間和二分之一的程序設定梯度時間（半梯度時間），我們就可以得到最大信號一半時的延遲時間和半梯度時間[3]，并且可以計算出流量所允許的延遲體積V50的倍增系數。理想的二元泵(沒有死體積，同時A、B兩通道操作完全相同)的V50的值與半梯度體積相同。換句話說，在到達半梯度時間點時，通道傳輸相同的流量和紫外信號最大值的一半是可以預計的。

當泵有確定的死體積時，到達最大信號半值的時間會發生延遲。如果A通道內泄漏，則會使A通道傳輸更少的流動相，導致最大信號半值更早發生，V50的值將減少(梯度比預料的稍微更陡)。在B通道微小的漏液將導致最大信號半值延遲，V50的值將變大。比較前后所獲得的紫外曲線，即使呈現不同梯度也可能并不是漏液的問題，而是 B的預處理 (在溶劑中丙酮的百分含量)不精確或紫外燈效能降低所導致的。

相比之下，無論信號最大值如何變化，V50的值是不變的。當V50的值確定后，在當前硬件配置中，它可以作為一個給定的泵(梯度識別) 的參比值。值得注意的是，這個值與壓力、溫度和硬件都有關。如果在V50中和之前的測量對比存在5%的偏差，但是診斷測試完全成功，作者則建議交換AB出口單向閥并重復測試。再次強調，V50的增加意味著B通道漏液，減低說明A通道漏液。轉換出口閥后重新檢查梯度運行，最新得到的V50值增加說明出口單向閥有故障，如果V50值仍然不變，說明在以上懷疑的通道中入口閥出現故障。

因為搭建的診斷測試不能識別微泄漏，所以嚴格控制V50的值對確保快速硬件診斷與維修而言就顯得尤為重要。被分析物保留時間的漂移可以很明確地指出與這個硬件相關的漏液情況。在40~60 min的梯度(常用的蛋白質組學分析)實驗中，我們應該評價每個溶液傳輸通道性能，用以排除硬件對保留時間不穩定的影響。如果V50值先前未確定或不能進行常規監控,那么診斷和維修會更為復雜和冗長。因此,使用高壓液體流量計對于系統性能控制而言，可能是快速的但卻花費昂貴的選擇。

[1] Dolan J.Check valve problems.LC·GC North Amer, 2006,24: 132 - 8.

[2] Rogatsky E, Braaten K, Cruikshank G, Jayatillake H, Zheng B, Stein D T.Flow inconsistency: the evil twin of column switching - hardware aspects.J Chromatogr A, 2009, 1216:7721 - 7.

[3] Dolan J.Dwell volume revisited.LC ·GC North Amer, 2006,24: 458 - 66.