蝴蝶蘭葉斑病病原真菌的分離與鑒定

崔亞華,余知和 (長江大學生命科學學院,湖北荊州434025)

蝴蝶蘭 (Phalaenopsisamabilis)為蘭科 (Orchidaceae)蝴蝶蘭屬植物,因花形似蝶而得名,大多數分布于熱帶地區,如中國臺灣和東南亞的泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等地,已發現有70個原生種,其中我國原產6個[1]。蝴蝶蘭株型優美、花色豐富、色彩絢麗、花姿優雅,素有 “蘭中皇后”之美譽,具有極高的觀賞價值和經濟價值[2,3]。近年來,隨著栽培面積及栽培區域的擴大,蝴蝶蘭病害也隨之大量發生。一些真菌或細菌性病害,因傳播速度快、潛伏期長等特征,常導致全株枯萎或死亡,失去觀賞價值,嚴重影響蝴蝶蘭工廠化生產,造成巨大經濟損失[4]。目前已報道的蝴蝶蘭常見真菌病害有炭疽病、白絹病、疫病、灰霉病、葉斑病等[5～7]。

筆者在蝴蝶蘭葉片上發現的病害癥狀初期為淡橙黃色、近圓形小斑,逐漸擴大成不規則的黑褐色病斑,邊緣模糊,后期葉片迅速失水黃化、枯萎,最后葉片斷裂、脫落至整株死亡。為了明確該病害的病原,并為有效防治該病害提供依據,筆者對其病原菌進行了分離與鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蝴蝶蘭病株采自湖北省荊門市荊門福農生物科技有限公司蝴蝶蘭生產基地,苗齡為100～120 d。分離獲得的真菌菌株保藏于長江大學生命科學學院微生物學實驗室。

1.2 病原菌分離

剪取蝴蝶蘭葉片病健交界處,用自來水沖洗干凈,再用吸水紙吸干組織表面水分,用75%乙醇處理20～30 s,無菌水沖洗3次,2%次氯酸鈉浸泡3 min,無菌水沖洗5次,然后將葉片切成長度約5 mm的小方片置于PDA平板上 (培養皿直徑9 cm),每皿5小片,3個重復,25℃恒溫暗培養。為抑制細菌生長,配制PDA時在滅菌前每升培養基中加入2 mL氯霉素[8]。待組織塊周圍長出菌絲,挑取菌絲邊緣菌塊,經多次轉接獲得純培養物,PDA斜面4℃冰箱保存備用。

1.3 分離菌株形態特征觀察

純化菌株接種于PDA平板上,25℃恒溫培養,記錄菌株生長速度,觀察菌落特征,挑取菌絲經乳酸石碳酸棉蘭染液染色制片后在顯微鏡下觀察菌絲體形態特征。

1.4 基因組DNA提取及ITS序列測定

將純化菌株接種至PDA液體培養基中,25℃恒溫振蕩培養4～6 d,收集菌絲體。按CTAB法提取基因組DNA[9],用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品的質量和濃度。選擇真菌核糖體rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCT TAT TGATATGC-3'),利用Applied Biosystems 2 720 Thermal Cycler(美國ABI公司)擴增5.8S rDNA及其兩側ITS1和ITS2基因片段。反應體系為25 μ L,其組分為:10×PCR 緩沖液2.5 μ L,10 μ m 引物1.25 μ L,10 mmol/L dNTP 0.5 μ L,2 U/μ L TaqDNA 聚合酶0.5 μ L(試劑均為鼎國公司產品), 模板 DNA 2 μ L, 雙蒸水17 μ L。擴增程序為:94℃預變性2 min,35個循環,94℃變性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程技術服務 (武漢)有限公司進行純化及雙向測序。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及其培養性狀

蝴蝶蘭葉片病斑經常規組織分離得到5個菌株,分別編號為 Pa1、Pa2、Pa3、Pa4、Pa5,具體分離結果見表1。

表1 蝴蝶蘭病原真菌分離結果

菌株Pa1～Pa4在PDA培養基上25℃培養,約7 d長滿9 cm平皿,菌落白色,氣生菌絲較發達,呈絮狀,菌絲分枝狀,有分隔。

菌株Pa5在PDA培養基上25℃培養,生長緩慢,7 d菌落直徑約2 cm,墨綠色,菌絲致密,呈絨狀,菌絲細長,較少分枝。Pa1～Pa4的菌落培養特征基本一致,而Pa5與上述4個菌株有顯著不同,因此初步將其劃分為2個分類單元。

2.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

為進一步確定所得病原菌的分類地位,選取2個代表菌株Pa1、Pa5對其rDNA-ITS序列進行分析。測序結果表明,菌株 Pa1、Pa5 ITS序列長度分別為565 bp和634 bp(GenBank登錄號依次為JF436948,JF436949),經BLAST[10]分析,Pa1的ITS序列與腐皮鐮刀菌 (Fusarium solani)近500個菌株的同源性高,E值為0.0,其中,與腐皮鐮刀菌分離物F.S.0613 ITS區段 (gb|HM064429.1|)的Identities=561/563(99%),Score值為1 100 bits(555)。

Pa5的ITS序列與瓶霉菌屬 (Phialophora sp.)的3個菌株的同源性高,E值為0.0,其中,與尖孢瓶霉菌 (Phialophora oxyspora)ITS區段 (dbj|AB190870.1|)Score=1 207 bits(609),Identities=616/617(99%),Gaps=1/617(0%)。

基于Landeweert等[11]對真菌分子鑒定,綜合形態觀察和序列數據分析結果,將菌株Pa1鑒定為腐皮鐮刀菌,Pa5初步鑒定為瓶霉菌。

3 討論

本研究從湖北荊門福農生物科技有限公司蝴蝶蘭生產基地的蝴蝶蘭葉片病斑部位分離到5株真菌,形態特征觀察及rDNA-ITS序列分析結果表明,這5個菌株為2個分類單元,其中1個鑒定為腐皮鐮刀菌。

腐皮鐮刀菌是一類分布廣泛的土傳病原菌,可侵染多種植物 (糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物),引起植物的根腐、莖腐等病害。康峰等[12]采用形態學觀察和分子鑒定方法對新疆甜瓜根腐病病原菌進行研究,確定病原菌為腐皮鐮刀菌。林蘭穩等[13]經顯微鏡直接檢查、病原菌分離培養觀察、致病性測定及田間病害調查,初步確定廣東鶴山粉葛根腐病是由腐皮鐮刀菌侵染引起的。周亞麗等[14]曾報道腐皮鐮刀菌是引致長春地區蝴蝶蘭根腐病的致病菌。本研究的腐皮鐮刀菌分離于蝴蝶蘭葉片部位,其根部并未表現出真菌病害的特征,兩者不同的侵染機制還有待深入研究。

據Lopez等[15]報道,尖孢瓶霉菌是引起馬足分支菌病的病原菌。而本研究還從蝴蝶蘭葉片病斑部位分離到1株與尖孢瓶霉菌親緣關系十分近的真菌,因未按照科赫法則進行致病性測定,故該菌株是否為蝴蝶蘭病害的病原菌,或者是否與腐皮鐮刀菌存在復合侵染,均有待于進一步研究。

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