石油污染對紫花苜蓿部分生理指標的影響

岳冰冰，李 鑫，任芳菲，孟凡娟，孫廣玉

(東北林業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

石油作為現代社會的主要能源，有“工業的血液”之稱。目前世界石油年產總量已達2.2×1012kg，但是同時每年約有8×109kg石油污染物進入環境，在我國，每年的新增污染土壤也有近1.0×108kg[1]。石油污染使土壤的土粒分散、通透性降低、結構破壞，特別是其中的多環芳烴，有致癌、致變、致畸等活性以及能通過食物鏈在動植物體內逐級富集，危害著人類健康。為了改善石油污染的環境，國內外研究學者采用各種技術對污染土壤進行修復，并取得了顯著性成果[2]。其中以生物修復技術具有處理費用低、無二次污染、對環境影響小、可就地處理、公眾接受程度高和處理效果好等優點，被認為是最具發展前景的方法[3]。植物修復技術是生物修復技術中的一種，以其具有吸收污染物能力強并兼顧美化環境的優點已成為人們普遍接受的去除石油污染物的首選技術。目前，人們已經從植物體內吸收、體內降解、根際降解和植物刺激等[4]方面著手研究植物修復技術的機理，并取得了較大進展。

紫花苜蓿(Medicagosativa)根系發達，主根粗長，入土深3～6 m，與土壤接觸面積大[5-7]，并能通過根際作用降解更多的表層石油烴污染物[8]。因此，本研究選取在石油污染修復中具有巨大潛力的紫花苜蓿為研究對象，通過盆栽試驗，對不同質量分數石油污染處理下紫花苜蓿的株高、葉片數、地上和根系干物質量等一些基本生理指標及其葉片中可溶性蛋白、淀粉、丙二醛、葉綠素含量等主要生理指標進行測定，初步探索紫花苜蓿對石油污染的耐受性，從而進一步為石油污染土壤的生物修復機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗條件 試驗在東北林業大學溫室內進行，地處125°42′～130°10′ E，44°04′～46°40′ N。溫室晝夜溫度變化為23～25 ℃，光照強度為400 μmol/(m2·s)，光照周期12 h/12 h(光/暗)，相對濕度75%左右。

1.2試驗材料 供試紫花苜蓿為自育品種“越冬之星”(黑龍江省審定品種)，受試污染物為采自大慶油田的原油。培養容器為26 cm×18 cm×8 cm(長×寬×高)的長方形平底塑料盤。發芽基質取自東北林業大學林場地表10 cm的清潔土，于室內風干、破碎、過1 mm篩。土壤有機質含量為19.4 g/kg，pH值為6.8，土壤速效氮為164.5 mg/kg，速效磷為96.4 mg/kg，速效鉀為600.4 mg/kg。

1.3試驗設計 本試驗采用混油法，設4個質量分數梯度： 0 mg/kg (CL0)，2 500 mg/kg (CL1)，5 000 mg/kg (CL2)，7 500 mg/kg(CL3)，每盆裝土1.5 kg，每處理3次重復。在土壤中均勻拌入一定比例的石油污染物(先將原油溶于石油醚中，然后與相應土壤混勻，吸附平衡24 h后再均勻散開)。將紫花苜蓿種子在0.05%的高錳酸鉀溶液中浸泡消毒10 min，然后每塑料盤中均勻撒播100粒種子，播深0.5 cm左右。2008年2月初播種，3月間苗，分別于4月9日、4月23日和5月6日采摘完全展開葉片，每個處理采摘10個葉片，采摘后立即在105 ℃烘箱中殺青10 min，65 ℃烘干至恒質量，待粉碎研磨后進行可溶性蛋白、淀粉、丙二醛及葉綠素含量的測定。于5月6日對紫花苜蓿的株高、葉片數、地上干物質量和根系干物質量進行統計。

1.4測定項目及方法 可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[9]；淀粉含量測定采用蒽酮法[10]；丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[11]；葉綠素含量測定采用丙酮法[12]；株高用直尺測量；干物質量用稱量法測定。

1.5數據分析 應用SPSS 13.0軟件對所得數據進行單因素方差分析，并用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1石油污染對紫花苜蓿生長的影響 隨著土壤中石油質量分數的增加，紫花苜蓿株高、葉片數、地上干物質和根系干物質量都有不同程度地降低，當石油質量分數為7 500 mg/kg時，分別比對照降低了71.1%、62.5%、48.1%和65.5%(表1)。分析表明，不同石油質量分數對紫花苜蓿株高、葉片數、地上干物質量和根系干物質量的影響達到極顯著水平(P<0.01)。

表1 不同石油處理對紫花苜蓿生長的影響

2.2紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量的變化 不同質量分數石油處理下紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量在4月9日和4月23日差異顯著(分別為FA=6.55>F0.05=4.07；FA=6.45>F0.05=4.07)(圖1)，而5月6日采摘的苜蓿葉片不同處理間差異不顯著(FA=1.39

不同石油污染處理對紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白質含量的影響如圖1所示。4月9日采摘的苜蓿葉片中，對照組(CL0)可溶性蛋白質含量最高，且顯著高于CL1和CL2處理(P<0.05)，CL3含量次之，CL2含量最低。而4月23日和5月6日采摘的苜蓿葉片則是CL0可溶性蛋白質含量最低，而混油處理的CL1、CL2和CL3的可溶性蛋白含量均顯著高于CL0。說明在石油污染的脅迫下苜蓿葉片中可溶性蛋白含量增加，且隨石油濃度的增大而呈增加趨勢，但當質量分數達到7 500 mg/kg時，可溶性蛋白含量反而下降，這可能是石油污染濃度超過了植物體可適應的臨界值，導致蛋白質含量降低。

4月9日-5月6日，苜蓿葉片可溶性蛋白含量逐漸下降，其中CL0組下降最多，降低了20.37%，而混油處理的3組CL1、CL2和CL3分別下降了14.44%、13.55%和15.74%(圖1)。

圖1 紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量

2.3紫花苜蓿葉片中淀粉含量的變化 不同質量分數石油處理下紫花苜蓿葉片中淀粉含量在4月9日和4月23日差異顯著(分別為FA=4.17>F0.05=4.07；FA=5.17>F0.05=4.07)，而5月6日采摘的苜蓿葉片不同處理間差異不顯著(FA=2.85

3次采樣的苜蓿葉片淀粉含量都隨石油質量分數的增加呈現先增高后降低的趨勢，且CL2處理的淀粉含量達最高值(圖2)。分析4月9日-5月6日采樣的數據，CL0、CL1淀粉含量分別上升了13.65%和3.43%，而CL2、CL3分別下降了2.33%和19.73%，說明隨著石油含量的升高，對植物生長過程中淀粉含量積累的促進作用有所降低。另外,4月23日淀粉含量明顯低于其他2次測定，具體原因有待進一步研究。

圖2 紫花苜蓿葉片中淀粉含量

2.4紫花苜蓿葉片中丙二醛含量的變化 不同石油污染處理下紫花苜蓿葉片中丙二醛含量在4月9日和5月6日差異不顯著(FA=3.37F0.05=4.07，P<0.05)，即不同質量分數石油污染對丙二醛含量有顯著影響，表現出石油脅迫可以使丙二醛含量增加，質量分數為2 500 mg/kg達到最高，其后隨著石油質量分數的增加而降低，但均顯著高于對照組(CL0)。5月6日采收葉片的丙二醛低于其他2個時期，這可能與紫花苜蓿抗逆性反應閾值有關，此時期紫花苜蓿已經渡過閾值期，對石油污染產生較強的適應性和耐受性。

圖3 紫花苜蓿葉片中丙二醛含量

在不同石油污染處理中，丙二醛的含量都隨采摘日期的推移而下降，分別降低了69.02%、60.67%、70.97%和68.49%，CL1的下降值明顯小于其他3種處理。

2.5紫花苜蓿葉片中葉綠素含量的變化 4月9日-5月6日隨著紫花苜蓿的生長，對照組(CL0)的葉片中葉綠素的含量沒有明顯變化。4月23日和5月6日采集的不同質量分數石油處理間紫花苜蓿葉片中葉綠素含量差異顯著(FA=4.09>F0.05=3.01)。

3次采集樣品中的葉綠素含量都隨石油質量分數的增加呈上升的趨勢，對照組CL0的葉綠素含量最低；并且CL0的葉綠素含量4月9日-5月6日逐漸降低，而混油的3組處理的葉綠素含量都有不同程度地上升，CL1、CL2和CL3分別增加了9.12%、11.19%和26.37%，說明隨著混油量的增加紫花苜蓿的葉綠素含量的上升量明顯加大。在5月6日的采集樣品中，CL3的葉綠素含量最大(圖4)。說明紫花苜蓿在石油污染情況下，可通過增加葉綠素含量提高光合能力來適應或補償逆境造成的損失，這也是植物對逆境的一種適應性反應。

圖4 紫花苜蓿葉片中葉綠素含量

3 討論與結論

石油主要成分為石油烴，大部分為高分子化合物，它們粘著在植物根系上形成一層粘膜，阻礙根系對營養元素的吸收和根系的呼吸功能，甚至引起根系的腐爛，而石油中的烴組分可以直接進入植物體內對植物造成直接傷害[13]。另一方面石油類物質進入土壤, 會破壞土壤結構，分散土粒, 使土壤的透水性降低，同時石油碳氫化合物污染的土壤會產生嚴重的疏水性，導致不能正常吸濕和儲存水分，從而阻礙植物生長[14]。本研究中石油污染土壤上種植的紫花苜蓿，其株高降低，葉片數減少，地上部干物質量和根系干物質量顯著下降，生長受到明顯的阻礙，可能的原因之一是原油污染導致幼苗養分失衡和生理脫水[15]。

可溶性蛋白是植物代謝的調控和促進物質，其含量是植物合成和代謝能力的重要指標。石油脅迫對紫花苜蓿中可溶性蛋白含量的影響，從總的變化趨勢看，經石油處理后可溶性蛋白含量均高于對照組，隨著處理質量分數的增加呈現先增后降的趨勢，這可能是在石油脅迫下，植物為了維持正常新陳代謝，產生了更多的蛋白質，或使細胞內的一些不可溶性蛋白轉化成了可溶性蛋白，這與李妮亞和高俊鳳[16]的研究結果相符。但當處理質量分數超過7 500 mg/kg時，苜蓿葉片中可溶性蛋白含量下降，這可能是由于超出了植物自身的耐受能力所致。

淀粉是植物體內的貯藏養分。植物中淀粉含量的高低在一定程度上反映出環境對植物的影響。本研究對4月9日、4月23日和5月6日3次采摘的紫花苜蓿葉片中淀粉含量進行了分析，結果是淀粉含量都隨著處理質量分數的增加有先升后降趨勢，這與曹文鐘等[17]的研究結果相類似。這可能是低濃度的石油促進了植物體內淀粉的積累，使植物對逆境的耐性增強。但當處理質量分數超過5 000 mg/kg時，葉片中淀粉的含量開始下降。隨著植物的生長，CL0、CL1的淀粉分別上升了13.65%和3.43%，而CL2、CL3分別下降了2.33%和19.73%，這說明隨著植物的生長，石油污染土壤對植物淀粉含量積累的促進作用有所降低。

丙二醛是植物在逆境和衰老條件下，膜脂發生過氧化作用的最終分解產物之一，其含量表示脂質過氧化強度和膜系統損傷程度。本研究結果顯示，石油污染可以使植物葉片中丙二醛含量增加，當處理質量分數為2 500 mg/kg時達到最高。這與馬麗等[18]的研究結果一致，即萘脅迫促使水稻(Oryzasativa)幼苗葉片中丙二醛含量隨萘濃度的增加而升高，處理質量分數為80 mg/kg時，丙二醛高于對照組59.97%。丙二醛含量升高可能是由于石油脅迫使植物體內的超氧化物自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)減少，活性氧增加，過多的氧自由基使細胞內多種功能膜及酶系統遭到破壞，植物生理代謝紊亂，引發脂膜過氧化，從而丙二醛含量增加[19]。

葉綠素是植物進行光和作用的主要色素，其含量的變化直接影響著植物的光合作用，是植物生長的重要生理參數，可用于指示植物逆境條件下的受迫害程度。但是，植物在土壤逆境的條件下，可通過地上部分的代謝來適應或補償土壤逆境帶來的生長損失。本研究結果中不同程度的石油污染提高了葉片中葉綠素含量，即促進了葉片中葉綠素的合成，通過光合能力來適應石油污染逆境。

綜上所述，不同程度的石油污染對紫花苜蓿有很大影響，葉片中可溶性蛋白和淀粉含量隨著土壤中石油含量的增加呈現先增加后降低的趨勢，而丙二醛和葉綠素含量明顯增加。從植物生理指標來看，紫花苜蓿對石油具有一定的耐受能力，而且前人研究結果表明紫花苜蓿對土壤石油污染物具有一定得去除率[8]。生長性狀受石油含量的影響極顯著，所以紫花苜蓿對石油污染土壤有很好的修復效果，不但能夠忍耐石油污染，而且能通過生物固氮作用為土壤提供有效的氮素來源，能很好地修復石油污染土壤。因此，紫花苜蓿是大慶油田具有很大潛力的石油污染修復植物。

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