5種棘豆總黃酮含量的測(cè)定比較

劉 璐，付明哲，王 俠，趙寶玉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院,陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712700; 3.咸陽(yáng)市渭城區(qū)畜牧局,陜西 咸陽(yáng) 712000)

棘豆屬(Oxytropis)植物為豆科植物，廣泛分布在我國(guó)西北、華北、西南等地，許多品種是蒙藥、藏藥的重要藥材。黃酮類化合物是其主要的藥用成分，迄今為止，已從該屬植物中分離得到黃酮類及其衍生物64個(gè)，其中黃酮17個(gè)，黃酮醇39個(gè)，異黃酮1個(gè)，異黃烷1個(gè)，二氫黃酮1個(gè)，查耳酮4個(gè)，二氫查耳酮1個(gè)[1]。許多研究表明，黃酮類化合物具有多種生物活性，在抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等方面有顯著效果，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[2-4]。黃酮類化合物的定量分析最常用的方法為液相色譜法和分光光度法。液相色譜法儀器昂貴，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品不易獲得，常用于黃酮單體定量測(cè)定；紫外可見分光光度法操作簡(jiǎn)單方便，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品易得，結(jié)果準(zhǔn)確。目前，關(guān)于棘豆屬植物總黃酮含量的分光光度法測(cè)定已有零星報(bào)道，劉妍等[5]用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測(cè)定了多葉棘豆(O.myriophylla)中總黃酮的含量;楊光明和王棟[6]用同樣的方法測(cè)定了鐮形棘豆(O.falcata)中總黃酮的含量。本研究在參考植物黃酮含量紫外分光光度測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，用紫外分光光度法測(cè)定了棘豆總黃酮含量，旨在為棘豆屬植物黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品及處理 樣品甘肅棘豆(O.kansuensis)、黃花棘豆(O.ochrocephala)、小花棘豆(O.glabra)、冰川棘豆(O.glocialis)和急彎棘豆(O.deflixa)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)系提供。樣品經(jīng)陰干、去雜、粉碎，過(guò)0.50 mm篩備用。

1.1.2主要試劑 蘆丁為對(duì)照品(中國(guó)藥品生物品檢定所，批號(hào)10080-200306)。三氯化鋁、石油醚、甲醇、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器 TG328A分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、D754紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司生產(chǎn))、KQ-1500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))、SHZ-III循環(huán)真空泵(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))和TU-1901紫外光譜儀(普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn))。

1.2方法

1.2.1棘豆總黃酮的提取 稱取6 g(平行3份)經(jīng)粉碎過(guò)篩預(yù)處理棘豆干粉，按1∶10的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在超聲頻率20 kHz、功率800 W，超聲溫度45 ℃條件下，提取45 min，過(guò)濾得濾液，再次超聲波處理，過(guò)濾。合并兩次濾液，抽濾，濃縮，用石油醚萃取，除去石油醚部分，將乙醇部分轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶，用甲醇定溶，作為樣品提取液。

1.2.2棘豆總黃酮類化合物的顯色反應(yīng)[7-8]

(1)醋酸鎂顯色反應(yīng)

在層析紙上滴加1滴濃縮的乙醇提取液，噴1%醋酸鎂甲醇溶液，干燥，紫外分光光度計(jì)365 nm下觀察紙斑的顏色變化。

(2)鉛鹽沉淀反應(yīng)

吸取1 mL的乙醇提取液置于試管中，加2滴2%醋酸鉛溶液，觀察變化。

(3)鹽酸-鎂粉反應(yīng)

吸取1 mL乙醇提取液置于試管中，加2滴濃鹽酸，再加鎂粉少許，觀察顏色變化。

(4)與堿液反應(yīng)

吸取1 mL的乙醇提取液置于試管中，加入10% NaOH溶液5滴，觀察顏色變化。

(5)硅膠G薄層色譜法

取濃縮的乙醇溶液，點(diǎn)于硅膠薄層板上，以氯仿∶甲醇(9∶1)展開，取出，晾干。再噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在紫外光燈下觀察。

1.2.3棘豆總黃酮的含量測(cè)定 利用黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上的酚羥基及其還原性羰基能夠與鋁鹽試劑形成有色絡(luò)合物，以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定不同品種棘豆總黃酮含量[7]。

對(duì)照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取在120 ℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁23.1 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度線，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

最大吸收峰的確定：樣品和蘆丁通過(guò)三氯化鋁顯色后，用掃描型紫外分光光度計(jì)在200～700 nm對(duì)其進(jìn)行掃描，通過(guò)對(duì)比蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的特征吸收曲線，判斷是否能用蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確吸取0.542 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL于8只10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%三氯化鋁甲醇液，用甲醇定容，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白，于274 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。以吸光度對(duì)蘆丁含量作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1棘豆總黃酮類化合物的顏色反應(yīng) 分別對(duì)5種棘豆屬植物黃酮類化合物進(jìn)行醋酸鎂反應(yīng)、鉛鹽沉淀反應(yīng)、鹽酸-鎂粉反應(yīng)、堿液反應(yīng)及硅膠G薄層色譜5種顏色反應(yīng)，鑒別結(jié)果見表1。供試樣品乙醇提取液均含有黃酮類化合物，其中甘肅棘豆、急彎棘豆及冰川棘豆的5種顏色反應(yīng)均呈陽(yáng)性，而黃花棘豆除堿液反應(yīng)呈現(xiàn)陰性外，其他4種反應(yīng)均呈陽(yáng)性，小花棘豆除鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陰性外，其他4種反應(yīng)均呈陽(yáng)性。

表1 5種棘豆屬植物中黃酮類化合物的鑒別結(jié)果

2.2棘豆與蘆丁對(duì)照品的紫外吸收光度 棘豆乙醇提取液與標(biāo)準(zhǔn)樣品蘆丁分別于200～700 nm波長(zhǎng)處掃描(圖1)，乙醇提取產(chǎn)物與蘆丁在274 nm均處有紫外光譜特征峰，因此可用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。

圖1 蘆丁、棘豆乙醇提取物紫外吸收光譜圖

2.3棘豆總黃酮含量測(cè)定 5種棘豆的平均總黃酮含量由高到低的順序依次為甘肅棘豆、小花棘豆、急彎棘豆、黃花棘豆及冰川棘豆，其中甘肅棘豆平均總黃酮含量顯著高于小花棘豆、急彎棘豆、黃花棘豆，極顯著高于冰川棘豆，冰川棘豆總黃酮含量最低(表2)。

3 討論與結(jié)論

黃酮類化合物是棘豆屬植物的主要藥用成分，黃酮類化合物在其基本碳架上含有堿性氧原子，而絕大多數(shù)都是帶有酚羥基的衍生物，因而能與某些金屬離子產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)，和某些較強(qiáng)的還原劑發(fā)生顏色反應(yīng)。鹽酸-鎂粉反應(yīng)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溶液由黃色逐漸變成紅色，說(shuō)明棘豆含有黃酮類化合物[9]。醋酸鎂和三氯化鋁與雙氫黃酮作用后，在紫外光下可呈現(xiàn)顯著的天藍(lán)色熒光和藍(lán)綠色熒光，而其他黃酮類化合物則呈黃色，表明棘豆含有雙氫黃酮類化合物。黃酮化合物與鉛鹽反應(yīng)會(huì)生成黃色或紅色沉淀[10]，色澤因羥基數(shù)目及位置不同而異。棘豆樣品與鉛鹽反應(yīng)有黃色沉淀生成，表明該提取物分子結(jié)構(gòu)中極有可能含有鄰二酚羥基，3-羥基、4-酮基或5-羥基的黃酮類化合物。

紫外分光光度法是應(yīng)用黃酮類化合物含有α-苯基色原酮基結(jié)構(gòu)，以及羥基與2個(gè)芳香環(huán)形成的2個(gè)共軛系統(tǒng)，對(duì)紫外光有2個(gè)相應(yīng)區(qū)域特征吸收，多采用在堿性介質(zhì)中加鋁鹽顯色的分光光度法。三氯化鋁顯色法依據(jù)三氯化鋁能與黃酮A環(huán)或B環(huán)上的鄰二酚羥基作用生成紅色絡(luò)合物，還可與具有3-羥基、4-酮基或5-羥基的黃酮醇類化合物作用生成絡(luò)合物，在274 nm 處形成新的吸收峰[11-12]。本研究表明，三氯化鋁顯色后，蘆丁和樣品在274 nm處有最大吸收峰，且完全重合，因此選擇蘆丁為測(cè)定時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品，274 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。本研究采用石油醚萃取，減少色素對(duì)結(jié)果的干擾，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。石油醚提取液的黃酮定性反應(yīng)為陰性，不會(huì)造成黃酮損失。

棘豆屬植物黃酮類化合物在長(zhǎng)期的生態(tài)適應(yīng)過(guò)程中為抵御惡劣生態(tài)條件、動(dòng)物、微生物等攻擊而形成的一大類低分子量的多酚類次生代謝產(chǎn)物[13]，植物次生代謝產(chǎn)物的生成受遺傳和環(huán)境的影響較大[14]，盡管不同品種棘豆屬植物中所含化學(xué)成分大致相同，但生長(zhǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致黃酮的含量不一。

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