地木耳提取液及根瘤菌對小葉錦雞兒幼苗生長的影響

劉曉云，郭振國，楊亞男，劉桂霞，王 娜，戴燕燕，王易鵬，郭小葉，魏 爽

(1.河北大學生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002；2.河北省保定市第三中學，河北 保定 071002； 3.西南林學院保護生物學院，云南 昆明 650224)

小葉錦雞兒(Caraganamicrophylia)是豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物，別名小檸條、牛筋條，我國是主要分布地區，從東北的呼倫貝爾草原到西北的甘肅等地都有自然分布[1]。小葉錦雞兒具有抗旱、耐寒、耐貧瘠的特點[2]，為固定、半固定沙地的優勢種[3]；同時兼具有豐富的營養，是牲畜的良好飼料，它是集“生態效益、經濟效益和社會效益”于一體的“三效合一”樹種[4]。目前，小葉錦雞兒在內蒙古科爾沁沙地[3]及內蒙古半干旱草原地區[5]、遼西地區[4]、河北宣化黃羊灘[6]等地得到應用，用于植被恢復、保育土壤、以及飼料防護林的培育工作。

地木耳(Nostoccommune)是一種地衣，俗稱地軟、地皮菜，是真菌和藻類的共生結合體，屬自養植物，可進行光合作用，在我國各地均有廣泛分布[7]。已有研究表明，地木耳提取液可有效提高小麥(Triticumaestivum)[8]、石竹(Dianthuschinensis)和孔雀草(Tagetespatula)[9]等種子的萌發及幼苗的生長；王靜等[10-11]研究了地木耳對土壤含氮量的影響，并將其作為肥料分別施用于馬鈴薯(Solanumtuberosum)及番茄(Lycopersiconesculentum)，觀察其營養生長及開花情況。結果表明，施用地木耳可增加土壤中的含氮量，并證實了它可以利用自身的碳源物質進行固氮作用，向周圍環境泌氨，具有明顯的增肥作用，現在國內已有地木耳的人工培育機構[12]。地木耳的這些優點可考慮應用在小葉錦雞兒的生長調節上，國內尚無這方面的研究。由于小葉錦雞兒是豆科植物，具有豆科植物共生固氮的特點，可以與根瘤菌形成根瘤，進行生物固氮以獲取氮素營養，目前對小葉錦雞兒根瘤菌的研究已有許多報道[13-15]。在菌劑應用方面，劉振龍和蔡安國[16]的研究表明小葉錦雞兒接種根瘤菌后，能顯著地提高植株幼苗的結瘤率，使其能更早地共生固氮，從而促進植物生長。

鑒于小葉錦雞兒的栽培和經濟價值以及根瘤菌菌劑與地木耳提取液對植物生長的調節作用，本研究將這2種微生物制劑應用在小葉錦雞兒幼苗生長上，以研究其對該植物生長的促進作用，探討其應用在小葉錦雞兒種植和栽培上的可行性，為該植物應用在干旱草原和沙化土壤的植被恢復中提供生物肥料。

1 材料與方法

1.1試驗材料 試驗用地木耳以及小葉錦雞兒根瘤菌、小葉錦雞兒種子，均由河北大學河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室提供。

1.1.1地木耳提取液的制備 新鮮地木耳(2010年5月采集于河北張家口沽源牧場)用水洗凈后，60℃烘干、粉碎，準確稱取0.1 g加入到1 L水中，用NaOH調節其pH值為10.0；80℃水解4 h，過濾取上清液，將濾渣重復水解一次，取上清液；將兩次上清液濃縮至100 mL，即得原液；用蒸餾水依次稀釋得到1/10原液、1/20原液、1/50原液。

1.1.2根瘤菌菌劑的制備 將小葉錦雞兒根瘤菌菌株HBU037001、HBU037002、HBU037003分別在YMA平板上活化后保存至斜面，然后接種于盛有100 mL YMA液體培養液的250 mL三角瓶中，于28℃恒溫搖床，轉速150 r/min培養48 h即得根瘤菌液體菌劑。

1.2試驗方法

1.2.1盆栽試驗 精選飽滿的小葉錦雞兒種子，95%乙醇浸泡3 min，0.1%氯化汞表面消毒5 min，用無菌水將消毒后的種子洗滌3～5遍。

分別用地木耳提取液原液、1/10原液、1/20原液、1/50原液4種劑量的地木耳提取液分別浸種6 h，并用蒸餾水進行相同處理作為對照組。

將種子播入花盆中，每盆播20粒種子，覆土1～2 cm，每種處理設置3個重復，共15盆，每天定時統計當天出苗數量；當種子不再萌發時，每盆保留5株長勢較好且一致的幼苗，每2 d分別用等量的不同劑量地木耳提取液噴施幼苗，用蒸餾水噴灑對照組植物。生長20 d后進行指標測定，測定株高(從子葉痕處至離生長點最近的展開葉頂端，每盆測量5株)、地上生物量(以第1片子葉葉痕處作為劃分標準，植物樣品先在烘箱中120℃殺青40 min，后于60℃烘干至質量恒定，每盆測量5株)、葉面積(將植株的葉片全部剪下，放在坐標紙上，統計葉片所占的格數，然后得出每株植物葉面積總數值，每盆測量5株)。

1.2.2田間試驗 選擇地木耳提取液原液的1/10、1/20和1/50共3個劑量處理，3個不同的根瘤菌菌劑處理及地木耳提取液和根瘤菌菌劑聯合處理9個組合，共15種處理；采用完全隨機區組設計樣方，每個樣方2 m×2 m，另設不進行地木耳和根瘤菌菌劑處理的空白對照，每個處理3個重復。

每個處理的播種量為55 g，約為1 200粒種子；將小葉錦雞兒的種子用地木耳提取液或根瘤菌菌劑分別浸泡6 h，播種時，用干燥的土壤將種子拌勻；地木耳和根瘤菌菌劑聯合處理時，先將小葉錦雞兒的種子用地木耳提取液浸泡6 h，再用菌劑處理2 h；每天定時統計當天出苗數量，每3 d分別用等量的不同濃度地木耳提取液噴施幼苗，其他處理及對照用蒸餾水噴灑葉面，50 d后觀察生長情況，指標測定方法同室內盆栽試驗，每個重復測定10株植物。

1.2.3數據分析 通過SPSS 13.0數學統計分析軟件對實驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)；在滿足方差齊性的情況下，再利用Duncan檢驗進行多重比較，確定各因子內部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1盆栽試驗 對盆栽生長20 d的小葉錦雞兒的種子出苗率、株高、干質量和葉面積進行了測定，統計結果見表1。

試驗結果表明，地木耳提取液對小葉錦雞兒的出苗率、株高和生物量均有顯著影響(P<0.01)。地木耳提取液原液對小葉錦雞兒的出苗率有明顯的抑制作用，1/20和1/50的稀釋液對出苗率的影響較對照和其他處理差異顯著(P<0.01)，1/20稀釋液的效果最好，出苗率可達48.3%；處理后獲得的植株株高與對照相比均具有顯著差異(P<0.01)，而各個處理之間的株高值無顯著差異(P>0.01)。

從生物量來看，各個處理與對照相比差異顯著，相比對照提高7.8%～21.9%，其中1/20的稀釋液提高幅度最大，與其他處理之間差異顯著(P<0.01)；比較其對葉面積的影響，1/20稀釋液與其他處理均差異顯著(P<0.01)，葉面積數值最高。

表1 盆栽試驗地木耳提取液對小葉錦雞兒出苗及生長的影響

2.2田間試驗 由盆栽試驗結果發現，地木耳原液對種子的萌發起抑制作用，因此田間試驗選取了1/10、1/20和1/50的地木耳稀釋液；選擇根瘤菌菌株HBU037001、HBU037002和HBU037003制作菌劑；種子經過表面處理后播種，2 d后開始出苗，植物生長到50 d開始測量植株高度、葉面積、生物量等指標。

統計分析表明，地木耳提取液和根瘤菌菌劑對小葉錦雞兒的出苗率、株高、生物量和葉面積均有顯著影響(P<0.01)。

表2 田間試驗地木耳提取液及根瘤菌菌劑對小葉錦雞兒出苗及生長的影響

根瘤菌菌劑HBU037001和HBU037002對種子的出苗率影響較其他處理顯著，菌劑HBU037001處理種子出苗率最高，在90%以上；地木耳提取液中，1/20稀釋處理出苗率較好，達到73.8%，其他各處理也均比對照有所提高。比較3種不同的處理方式，1/50地木耳提取液、根瘤菌菌劑HBU037001以及聯合處理1/10地木耳提取液與菌劑HBU037001等較對照相比，株高差異顯著(P<0.01)，其中根瘤菌菌劑HBU037001處理的植物株高最高。

從生物量來看，1/20地木耳提取液、菌劑HBU037002等對小葉錦雞兒的生物量較對照具有顯著的差異，較對照分別提高11.5%和17.7%；綜合來看，地木耳提取液1/10與菌劑HBU037001的聯合處理又較其他處理差異顯著，生物量提高達到28.2%。在葉面積的測定中，1/20、1/10稀釋的地木耳提取液、菌劑HBU037002以及聯合處理1/10地木耳提取液+菌劑HBU037001等較對照具有顯著差異，其中1/20稀釋的地木耳提取液效果最好，相比對照提高42.8%。

3 討論

本研究結果顯示，不同的根瘤菌菌株對于植物的生長影響差異較大。在3個供試菌株中，菌株HBU037001處理的種子出苗率最高，而菌株HBU037002提高幼苗的干質量幅度最大。已有研究[17]表明，根瘤菌的施用可以提高植物種子的萌發率，這對于植物在干旱環境中定植非常重要。因此，小葉錦雞兒的種植需要接種根瘤菌菌劑以提高其對干旱的抗性。因此，在今后的研究中，應多篩選不同的根瘤菌菌株進行研究，將不同菌株的優點結合起來，對其特性研究，以選擇表現最優的根瘤菌菌株制作菌劑，在生產上進行應用。

地木耳提取液處理對植物的干質量影響較顯著，但根瘤菌菌劑與地木耳提取液的聯合處理(地木耳提取液1/10原液+菌劑HBU037001)為所有處理中提高植物干質量最高者，這可能與兩者對植物生長調節的累加作用有關。地木耳葉面噴施可以使營養物質從葉面輸送，促進植物快速吸收地木耳提取液中的營養物質，而根瘤菌與植物形成的根瘤能利用空氣中的游離氮合成氨，促進植物根際發育，使生物量增加。根據盛家榮等[18-19]的研究結果，地木耳提取物中起促進植物生長作用的物質主要是多糖，而在根瘤菌與豆科植物的識別機制當中，根瘤菌表面多糖是植物與根瘤菌互作的必需物質[20]，所以地木耳也間接地影響著根瘤菌的活動；此外根瘤菌除了固氮活性外還可以活化土壤中的微生物群落，為植物提供磷、鉀等其他營養及多種微量元素[21-23]，并可有效影響土壤呼吸速率[24]。

本研究證實這兩種微生物制劑對小葉錦雞兒的種植具有應用價值，這兩種微生物制劑成本低，制作簡易、無污染，是制作生物肥料的理想材料。今后將進一步篩選更多的高效固氮根瘤菌菌株，并選擇人工培育的地木耳作為材料進行研究，從而對這兩種微生物制劑進行研究和開發，減少化肥使用并節約國家資源[25]，為我國"退耕還林"、貧瘠土壤植樹造林、以及在干旱草原和荒漠草原植被恢復服務。

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