實驗性糖尿病酮癥酸中毒家兔Ⅰ型肺泡上皮結構和功能變化的研究

顧小軍，常家寶，朱曉云

(東南大學 附屬第二醫院，江蘇 南京 210003)

糖尿病酮癥酸中毒(diabetic ketoacidosis，DKA)是糖尿病常見的危重并發癥。近年來的研究證實，肺是糖尿病高血糖損害的靶器官[1]。糖尿病高血糖可引起急慢性肺部感染(慢性支氣管炎[2]、細菌性肺炎[3]、肺結核[4]、真菌感染[5]以及機會性感染[6])、肺功能下降(氣體交換[7]及彌散功能[8]下降)、肺部腫瘤等肺部病變，即使是糖尿病傾向者也存在肺功能下降[9]，嚴重者可出現肺水腫[10]、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[11]等而危及生命。目前研究DKA肺損傷的資料漸多，大部分資料集中于糖尿病肺功能[12]、免疫組化[13]及炎癥因子[14]等的改變，部分資料研究了肺泡Ⅱ型上皮的變化[15]。但Ⅰ型上皮細胞為肺部主要組織細胞，是構成氣血屏障的重要部分，其結構和功能的變化直接影響著氣體的交換，而DKA時Ⅰ型肺泡上皮細胞器發生的超微結構和功能變化情況尚未明了。我們使用新西蘭家兔制作了DKA模型，研究DKA家兔Ⅰ型肺泡上皮細胞的損傷情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭雄性家兔12只，由江蘇省農業科學院提供，體重1.65 ～3.25 kg。

1.2 實驗材料

鏈脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶、細胞組化試劑均為Sigma公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 DKA模型制作方法 參照Harrs等[16]的方法，12只家兔隨機分為實驗組(DK組)和對照組(NS組)各6只，實驗前常規測尿酮體、體重和血糖。所有動物予相同的飼養條件，DK組經耳緣靜脈注射STZ 150 mg·kg－1和四氧嘧啶 150 mg·kg－1，NS 組予等劑量生理鹽水。注射藥物后 24 h 內按 0、1、3、6、12、24 h 測量血糖、體重，出現低血糖者予靜脈補充葡萄糖液;24 h后每12 h測量血糖、尿酮體、體重，0.45%氯化鈉加10%右旋糖酐按100 ml·kg－1補液。72 h后 DK組動物血糖皆大于16.7 mmol·L－1，尿中出現酮體。所有動物均清醒，氯胺酮0.05 g腹腔麻醉后檢測動脈血氣，處死取肺組織留取標本，進行透射電鏡、細胞酶組化觀察，研究Ⅰ型肺泡上皮溶酶體及細胞膜功能變化。

1.3.2 透射電鏡標本的制備方法 標本采集后用2.5%戊二醛固定，常規電鏡制樣，超薄切片，電子染色，用日產H-600電子顯微鏡觀察超微結構。

1.3.3 細胞組化法 依照Lewis等[17]的方法行電鏡下堿性磷酸酶(ALP)檢測:取下組織，固定在0.5%戊二醛和2%多聚甲醛固定液中。手工切片，厚度不超過40 μm，緩沖液沖洗。40 mmol·L－1tris(pH 9.2)，8 mmol·L－1β-甘油酸鈉和 2.4 mmol·L－1硝酸鉛中室溫哺育，60 min后沖洗，后固定于鋨酸中，環氧樹酯包埋、超薄切片。不作染色，直接用電鏡觀察。每個樣本都做陰性對照，僅不加甘油酸鈉，其余各項均相同。

1.4 數據分析

2 結 果

2.1 兩組實驗前后血糖、體重、酮體及電解質變化

兩組注藥前后血糖和體重測定結果見表1，DK組符合DKA診斷標準。

表1 兩組血糖和體重的變化(±s)

表1 兩組血糖和體重的變化(±s)

a與 NS組相比，P ＜0.01;b 與治療前相比，P ＜0.01

5.18 ±0.84 5.96 ±1.60 2.26 ±0.42 2.68 ±0.78 DK 組(n=6) 4.22 ±1.53 24.3 ±3.80a，b 2.43 ±0.75 2.34 ±0.15a，/kg治療前 治療后 治療前 治療后NS組(n=6)血糖/mmol·L －1體重組 別b

由表1可見，血糖值兩組實驗前差異無統計學意義，NS組實驗前、后比較差異也無統計學意義，DK組實驗后明顯高于實驗前(P＜0.01);體重的變化NS組實驗前后為+0.42 kg，而DK組實驗前后為－0.09 kg，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。尿酮體檢測DK組注藥前為陰性，注藥后皆轉為陽性，NS組注藥前后未有變化。

注藥后72 h，兩組血漿滲透壓、血氣和血電解質測定結果差異均有統計學意義(均P＜0.01)，見表2。

2.2 NS組和DK組Ⅰ型肺泡上皮超微結構改變

NS組肺泡結構正常。DK組Ⅰ型肺泡上皮超微結構可見細胞膜結構模糊，細胞基底膜增厚、中斷，細胞膜外可見大量高電子物沉積，肺泡膜明顯增厚，血竇內可見紅細胞與內皮細胞黏附等改變(圖1)。

表2 兩組血漿滲透壓、血氣和血電解質的比較(±s)

表2 兩組血漿滲透壓、血氣和血電解質的比較(±s)

a與 NS組相比，P ＜0.05;b 與對照組相比，P ＜0.01

311 ±13.20 97.85 ±1.02 19.55 ±3.23 34.25 ±3.82 DK 組(n=6) 340.8 ±15.9a 58.9 ±2.31a 8.56 ±0.71b 27.55 ±6.29陰離子間隙NS組(n=6)組 別 血漿滲透壓/mmol·L－1 動脈血氧飽和度/% 血漿碳酸氫根/mmol·L－1 a

圖1 DK組Ⅰ型肺泡上皮細胞損傷 ×17 000

2.3 ALP 活性變化

NS組肺組織ALP活性位于細胞膜、線粒體上，見點線狀著色、分布均勻、規則的顆粒(圖2)。

圖2 NS組Ⅰ型肺泡上皮細胞膜表面的ALP顆粒，沿細胞膜表面呈現規則的線狀排列，分布均勻，細胞內的細胞器膜也有顯示 ×12 000

DK組肺組織Ⅰ型上皮細胞膜上ALP顆粒消失，線粒體上活性變小;血管內皮細胞膜上活性明顯降低(圖3)。

圖3 DK組Ⅰ型肺泡上皮細胞ALP組化結果 ×10 000

3 討 論

近年來國內外多項研究均證實肺是糖尿病損傷的靶器官[18]。糖尿病對肺的影響主要以微血管病變引起的肺間質損害為主[3]，表現為:終末糖基化產物增多，細胞間基質增生;糖尿病肺微血管病變出現基底膜增厚、透明性變，血管壁硬化和管腔阻塞，肺泡上皮增厚，肺泡隔透明性變和硬化，肺泡腔內積聚巨噬細胞和代謝產物，氣-血屏障增厚等改變;28周糖尿病大鼠肺上皮細胞和毛細血管基底膜不同程度增厚，肺泡巨噬細胞偽足減少，肺泡數目增多[19];糖尿病大鼠早期肺即發生形態學變化[20]，DKA病人CT掃描可見肺水腫[21]，甚至出現 ARDS[11]危及生命。我們觀察到DKA家兔Ⅰ型肺泡上皮細胞存在基底膜增厚、細胞膜表面模糊、細胞外有高電子密度的無定形物等改變，在血竇可見紅細胞、粒細胞黏附于血管內皮細胞上，氣-血屏障顯著增厚等變化，說明DKA時存在明顯的Ⅰ型肺泡上皮細胞結構損傷。

ALP為細胞膜上參與物質轉運的酶，該酶活性的強弱和分布的狀況反映了細胞膜的轉運功能，ALP細胞組化染色可以觀察細胞膜上ALP活性變化;其活性與膜轉運功能活躍正相關。有些研究者用ALP細胞組化法觀察心肌膜損傷[22]。近年來，我們多次用ALP細胞組化法觀察肺泡細胞膜的損傷，它是觀察組織細胞膜損傷比較好的敏感指標[23-24]，是直接觀察和判斷細胞膜、細胞器膜性功能變化的直接證據。DKA時機體酸性物質過多，組織的能量代謝障礙，細胞膜的能量供應大幅減少，造成ALP轉運功能明顯下降。DK組Ⅰ型肺泡上皮ALP活性下降明顯，細胞物質轉運顯著減少，細胞能量代謝出現障礙，使組織損傷加重。

本研究顯示，DKA時存在Ⅰ型肺泡上皮結構和功能的損傷，膜性結構的破壞和細胞膜及細胞器膜功能下降起了重要作用。

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