血小板活化特異性標志物PAC-1和CD62p與急性腦梗死病情嚴重程度的相關性☆

張炘段傳志李鐵林龍霄翱何旭英譚峰方美鳳黃彪

·論 著·

血小板活化特異性標志物PAC-1和CD62p與急性腦梗死病情嚴重程度的相關性☆

張炘*段傳志*李鐵林*龍霄翱**何旭英*譚峰△方美鳳△黃彪△

目的 探討急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）患者血小板膜糖蛋白（glycoproteinⅡb／Ⅲa，GPⅡb／Ⅲa）纖維蛋白原受體PAC-1和P選擇素（P-Selectin，CD62p）與ACI患者病情嚴重程度的相關性。方法采用流式細胞儀技術分別檢測58例ACI患者急性期（＜7 d）外周血PAC-1和CD62p含量，同時采用Barthel指數和NIHSS量表評分法對ACI患者進行神經功能學評分，并選取20名健康人作為對照組進行參考值測定。結果 與對照組（0.22±0.13；4.21±1.11）相比，ACI患者 PAC-1含量（0.92±0.40）和 CD62p含量（7.07± 3.07）在急性期（＜7 d）顯著升高（P＜0.05；P＜0.05），且與ACI患者病情嚴重程度成正相關（P＜0.05；P＜0.01）。 結論 PAC-1和CD62p與ACI患者病情嚴重程度呈正相關。早期檢測PAC-1和CD62p水平對于預防ACI發生、評估病情輕重以及判斷預后有著重要的意義。

PAC-1 CD62p ACI 病情 相關性

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是由于急性腦供血障礙引起腦組織缺血、缺氧，神經元損傷的危重疾病，是人類疾病的三大死亡原因之一。腦血栓形成是腦梗死常見的病因［1-2］，血小板活化與微血栓形成密切相關［3-6］。 研究表明，血小板膜糖蛋白（glycoproteinⅡb／Ⅲa，GPⅡb／ⅢIa）纖維蛋白原受體 PAC-1和P選擇素（P-Selectin，CD62p）是目前檢測血小板活化程度和功能狀態的特異性指標，檢測PAC-1可以反映血小板早期活化情況［7-8］，而CD62P則是后期血小板活化的標志物［］。

目前，對于PAC-1和CD62p的研究更多停留在探討其在ACI發生發展過程中的作用和意義上，而關于PAC-1和CD62p與ACI患者病情嚴重程度是存在直線性關聯、是否有助于判斷ACI患者預后的研究相對甚少。本文通過研究急性期ACI患者外周血PAC-1和CD62p的含量與ACI患者病情嚴重程度的相關性，為評估ACI患者病情輕重以及判斷預后提供新的理論依據。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 選取2007年11月至2008年4月住院部ACI患者58例，其中男30例，女28例，年齡40～84歲，平均年齡為（67.67±10.52）歲；從發病到醫院就診時間最長為6 d，最短為4 h。診斷均符合1995年全國第四屆腦血管病會議制定的診斷標準，且所有病例均經頭顱CT或MRI確診，排除其他存在的血栓及凝血性疾病。心電圖、肝腎功能均正常。同時選取體檢中心的健康人20名，其中男11名，女9名，年齡42～69歲，平均年齡為（59.70±9.49）歲。

1.2 病例標準

1.2.1 納入標準 ①起病時間在1周以內，年齡在40～85歲之間；②頸內動脈系統第一次發生的單側腦梗死；③本次發病前無嚴重殘疾，mRS≤3；④NIHSS評分≥2；⑤符合上述診斷標準者均可作為試驗病例。

1.2.2 排除標準 ①年齡＞85歲者或年齡＜40歲者；②短暫性腦缺血發作、蛛網膜下腔出血、腦出血、腦干和小腦梗塞者；③發病前有影響功能恢復的神經或肌肉骨骼疾病；④NIHSS評分≤1；⑤重度認知功能障礙；⑥急性心肌梗死、血液病、嚴重感染、活動性肺結核、肝腎功能嚴重損害、上消化道大出血患者；⑦已經服用影響血小板活化藥物的患者。

1.2.3 剔除和脫落病例標準 ①未按規定治療，無法判斷療效者；②資料不全者影響療效或安全性判斷者；③治療過程中發生意外事件而不能堅持治療者；④治療過程中患者不配合治療者。

1.3 指標檢測

1.3.1 樣品制備 采血：全部患者在入院第1天抽取靜脈血3管（含0.1 mL的3.8%枸櫞酸鈉玻璃試管）各2 mL。

1.3.2 PAC-1和 CD62p的檢測 第1、2管分別從中吸5 μL全血，分別加入對照管和實驗管。剩下的全血加入ADP1 μmol刺激15 min，使血小板活化。從中再取5 μL全血分別加入FL1及FL2的補償管中。加入3種熒光素標記的單克隆抗體。在對照管管中加入 FITC-IgM、PE-IgG1及，PerCP-CD61單抗各 20 μL。在FL1的補償管中分別加入FITC-IgM、PerCD62P及Per-CP-CD61單抗各 20 μL。在FL2的補償管中分別加入 FITCPAC1、PE-IgG1及PerCP-CD61單抗各20 μL。在實驗管中分別加入FITC-PAC1、PE-CD62P及PerCP-CD61單抗各20 μL。室溫，避光20 min后，用1%PFA250 μL固定10 min，1 h之內完成樣品制備，采用流式細胞儀FACS Calibur（美國B.D公司）檢測PAC-1和CD62p的陽性表達率。激發光為離子激光器488 nm單普線，功率15 mw。

1.4 神經功能評分 患者入院第1天，采用美國國立衛生研究院卒中量表（the NIH stroke scale，NIHSS）評分評估患者病情。評定標準 （1989年美國國立健康研究所）：NIHSS評分≤1為正常受試者，中風輕型 （NIHSS≤4）、中風中型（NIHSS在5～20分之間）、中風重型（NIHSS＞20分）。

1.5 統計學方法 采用SPSS 10.0統計分析系統進行分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。相關性分析采用直線回歸。檢驗水準a＝0.05。

2 結果

在急性期 （＜7 d），ACI患者PAC-1含量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表1）；CD62p含量較健康人組也明顯升高，差異有統計學意義 （P＜0.05）（見表2）。PAC-1和CD62p水平隨著病情輕重的升高呈一個遞增的趨勢（表3、4）。

經直線分析，PAC-1與NIHSS評分高低之間存在直線關系 （t＝1.84，P＝0.04）（見表5圖1）；CD62p與NIHSS評分高低之間也存在直線關系（t＝2.45，P＝0.00）（見表6圖2）。進入回歸方程，PAC-1與 NIHSS評分存在明顯相關性 （P＜0.05），CD62p與NIHSS評分也存在明顯相關性 （P＜0.01），說明PAC-1和CD62p水平高低與NIHSS評分高低呈正相關（表7），PAC-1和CD62p水平越高，NIHSS評分也越高，患者病情越嚴重。

3 討論

3.1 血小板活化與腦血栓形成的關系 大量研究表明，血栓形成是急性腦梗死常見的病因［1－2］。腦血栓形成的發病因素包括血管內膜的損傷、血液流變學改變、血小板活性改變、纖溶活性改變等諸多因素，其中血小板活化是血栓形成的重要環節［3－4］。

在生理狀態下，血小板基本處于靜息狀態，靜息狀態下的血小板并不黏附于內皮細胞形成聚集。病理狀態時，血小板與血管壁相互作用，損傷的血管壁上暴露的膠原、凝血酶等促使血小板形態發生變化，偽足形成，Ca2＋流動和細胞內磷酸化反應，促使血小板在內皮細胞上黏附伸展，與纖維蛋白原連接，通過橋聯作用促使血小板聚集，并釋放活性內容物，后者作用于血管壁，使平滑肌細胞收縮并增殖，從而誘導血管痙攣，該過程統稱為血小板的活化反應［10］。活化血小板是血栓主要成分之一，在ACI缺血和缺血－復流腦損害發生、發展過程中起著重要的作用［11］。在各種致病因素的作用下，血小板受到刺激被激活后發生黏附、聚集［12－13］，并釋放出顆粒性物質，后者反過來促進血小板黏附、聚集過程和腦梗死的發生［5，14］。

表1 ACI組與對照組PAC-1含量的比較

表2 ACI組與對照組CD62p含量的比較

表3 不同病情ACI患者（NIHSS量表評分）與PAC-1的相互關系

表4 不同病情ACI患者（NIHSS量表評分）與CD62p的相互關系

表5 PAC-1和NIHSS評分的相關性分析

表6 CD62p與NIHSS評分的相關性分析

表7 NIHSS評分與ACI患者PAC-1和CD62p含量的相關性分析

3.2 PAC-1和CD62p與ACI的關系 GPⅡb／Ⅱa是血小板膜上的一種糖蛋白，GPⅡb／Ⅲa在受損血管的血小板黏附和血栓形成過程中起著重要作用［15－16］。血小板活化后10s內GPⅡb／Ⅲa最大限度活化［16］。PAC-1作為GPⅡb／Ⅲa復合物纖維蛋白原的受體，只與活化血小板上的GPⅡb／Ⅲa結合，與纖維蛋白原結合從而介導血小板聚集，是引起血小板聚集的最后通路。研究發現，PAC-1能結合活化的血小板，但不能結合未受刺激的血小板。因此，檢測PAC-1可以反映血小板早期活化情況［7－8］。Meiklejohn等［9］用流式細胞術檢測 150例腦梗塞患者發現，與對照組相比，患者PAC 1表達顯著增加（P＜0.001）。

CD62P即P選擇素，是由McEver等［17］首先在活化的血小板膜上發現的相對分子質量為140×103的糖蛋白，是血小板α顆粒發生釋放反應的標志物，合成并儲存于內皮細胞的Weibel Palade小體和α顆粒內。在凝血酶、組胺、氧自由基、腫瘤壞死因子等刺激下，血小板黏附、激活，使原本存在靜息血小板胞漿內a顆粒膜上的糖蛋白CD62P迅速表達于活化的內皮細胞和血小板表面， 是后期血小板活化的標志物［7，9，16］。CD62P在血小板活化后 10 min表達可達高峰［14］。Belniak-Legiec等［6］用流式細胞術檢測50例ACI患者發現，缺血性卒中急性期（第1、3和7天）CD62P表達呈顯著增加。Meiklejohn等［9］發現，血栓性卒中患者 CD62P表達較對照組顯著增加（0 64%對0 35%，P＜0.001）。Yip等［5］用流式細胞術對87例ACI者進行檢測發現，CD62P表達在急性期較對照組顯著增加。

3.3 PAC-1和CD62p與ACI病情嚴重程度的相關性 PAC-1和CD62p作為血小板早期和晚期活化的標志性指標，不僅能反映ACI早期血小板活化狀態，還能反映ACI患者病情的嚴重性。Cha等［18］發現急性期缺血性卒中病人CD62p的表達和疾病的惡化明顯呈正相關，并提出CD62p的表達升高是病情進程惡化的一個標志。本實驗結果發現，在ACI早期，PAC-1水平與NIHSS評分存在明顯正相關 （P＜0.05），CD62p水平與NIHSS評分也存在明顯正相關（P＜0.01），通過直線回歸分析，我們發現，PAC-1和CD62p與NIHSS評分存在明顯的線性關系，說明ACI患者血中PAC-1和CD62p水平越高，NIHSS評分也越高，患者病情程度越嚴重。因此，PAC-1和CD62p水平高低可以在一定程度上反映患者病情，早期檢測ACI患者血中PAC-1和CD62P水平，可以及時了解患者病情嚴重情況。

3.4 結語 PAC-1和CD62p與ACI作為血小板活化的特異性標志物能在早期反應機體血小板活化程度，且與患者病情嚴重程度呈正相關。早期檢測PAC-1和CD62p水平對于預防ACI發生、評估病情輕重以及判斷預后有著重要意義。

圖1 PAC-1和NIHSS評分的相關性分析

圖2 CD62p與NIHSS評分的相關性分析

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（責任編輯：李立）

R743.3

A

2011－02－22）

☆ 廣東省醫學科學技術研究基金項目（編號：WSTJJ 20051101430103590927157）

* 南方醫科大學珠江醫院神經外科，廣東神經外科研究所（廣州 510282）

△ 廣州中醫藥大學附屬佛山中醫院神經內科