eNOS基因多態性與漢族人糖尿病合并頸動脈粥樣硬化關系

盧瑞春王昊郁金泰譚蘭

·論 著·

eNOS基因多態性與漢族人糖尿病合并頸動脈粥樣硬化關系

盧瑞春*王昊△郁金泰*譚蘭*

目的 探討內皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，eNOS）基因第4內因子基因27 bp數目可變的串聯重復序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多態性與糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的關系。方法 納入189例糖尿病合并頸動脈粥樣硬者和240名對照，分析各組間的等位基因頻率與基因型頻率的差異。結果 糖尿病合并頸動脈粥樣硬化患者的 a等位基因頻率高于對照組 （9.78%、6.04%，χ2＝4.119，P＜0.05），差別有統計學意義；4a／4b＋4a／4a基因型頻率在糖尿病合并頸動脈粥樣硬化組高于對照組 （17.38%、11.65%，χ2＝5.518，P＜0.05），差異有統計學意義。用Logistic回歸分析發現4a等位基因與糖尿病合并頸動脈粥樣硬化具有顯著相關性（OR＝1.594，95%CI 1.256－1.741，P＜0.000）。用多元Logistic回歸分析校正了年齡、高血壓、高血脂、體重指數和吸煙等危險因素的影響后，a等位基因是糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的遺傳危險因素（OR＝0.717，P＜0.001）。證實eNOS基因VNTR多態性是影響漢族人群中糖尿病患者發生頸動脈粥樣硬化的獨立危險因素。結論 在漢族人群中糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的發病與內皮型一氧化氮合酶（eNOS）第4內含子a等位基因密切相關。

內皮型一氧化氮合酶 基因多態性 糖尿病 頸動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化和心腦血管疾病密切相關， 其中頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis）被認為是缺血性卒中的重要危險因素之一［1］。 頸動脈粥樣硬化是全身性動脈粥樣硬化的局部表現，是腦血管病的重要原因之一［2］，也是糖尿病并發大血管病變的主要并發癥之一。 糖尿病并發頸動脈粥樣硬化的發病率很高，其發生發展受許多因素影響，如吸煙、肥胖、脂代謝異常和高血壓等。有研究表明這些已知危險因素僅增加糖尿病患者的心腦血管疾病發病率的25%～30%［3］，這說明在糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的發病機制中還有其他因素起著重要作用。已有研究證實，一氧化氮（nitric oxide，No）是抑制動脈粥樣硬化形成的關鍵因素［4］。而一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）第4內含子基因數目可變性串聯重復序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多態性與NO的功能密切相關［5］。eNOS第4內含子基因數目VNTR多態性是否影響漢族人糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的發病尚需進一步研究證實。

1 對象與方法

1.1 研究對象 糖尿?。?型）并頸動脈粥樣硬化組（病例組）：189例，男102例，女87例；年齡45～95歲，平均（60.4±8.1）歲。均來自2005～2009年青島市市立醫院神經內科住院患者。對照組：240例，男125例，女115例，平均年齡（58.3±5.6）歲，此組經體檢、實驗室及心電圖檢查，僅有糖尿病，排除頸動脈粥樣硬化、腦血管疾病、心肌梗死、肝腎功能不良等情況。入組標準：①所有患者的糖尿?。?型）診斷均符合美國糖尿病聯合協會的診斷標準［6］；②采用彩色多普勒超聲儀確診為頸動脈粥樣硬化并確定狹窄程度。排除標準：①經顱腦TCD、頭顱CT及MRI檢查證實，排除腦卒中疾病；②心肌梗死病史；③急慢性感染、腫瘤或自身免疫性疾病患者及有明顯的肝功能、腎功能障礙或心功能衰竭者。被檢查者均以發現頸總動脈或（和）頸內動脈粥樣硬化斑塊為陽性，每例被檢查者不計斑塊數，只計例數。對所有研究對象記錄臨床特征如：民族、年齡、性別、血壓、血脂、有無吸煙嗜好及體重指數等。

1.2 方法 試驗前DNA的提?。呵耙菇?2 h以上，次晨空腹抽取檢查對象外周靜脈血2 mL，經EDTA抗凝，用于提取基因組DNA。

1.2.1 基因型檢測

1.2.1.1 基因組DNA提取 EDTA抗凝全血2，分離出淋巴細胞，經細胞裂解液裂解和蛋白酶K消化后，常規酚－氯仿抽提DNA。

1.2.1.2 多聚酶鏈反應（PCR）擴增目的片斷 上游引物：5′-GCCCTATGGTAGTGCCTTGGCTGGA-3′； 下 游 引 物 ：5′-GAGGCTGCTCCTGCTACTGACAGCAC-3′。經過PCR擴增目的片斷，實驗方法與H.G.Wang相同［7］。取3 μL PCR擴增產物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上做垂直電泳，電壓60 V，時間3 h，PCR Marker作參照，在0.5 μg／mL溴化乙錠染液中染色40 min后在紫外線燈下觀察結果。

1.2.1.3 基因型的確定 PCR產物以2%瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色，紫外燈下確定基因型。

1.2.1.4 基因序列測定 不同基因型的擴增產物送上海生工公司測定DNA序列，明確VNTR長度和重復次數。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行統計分析。為考察資料的可靠性對糖尿病合并頸動脈粥樣硬化組和對照組的基因型分布進行 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗；基因型頻率和等位基因頻率差異采用χ2檢驗；采用logistic回歸計算OR值及其95%CI。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 eNOS基因27 bp VNTR基因多態分型及結果判定標準 內皮細胞型一氧化氮合酶基因型多態性表現為數目可變的串聯重復序列（variable number of tandem repeat，VNTR），5次重復等位基因的PCR擴增片段長420 bp和4次重復等位基因的PCR產物長393 bp。（見圖1）共有3種基因型：aa，ab，bb。電泳后條帶分為3種：只有393 bp條帶為aa基因型，只有420 bp條帶為bb基因型，同時有393 bp和420 bp條帶的為雜合ab基因型。

2.2 臨床特征 對糖尿病合并頸動脈粥樣硬化組（病例組）和對照組樣本的臨床特征進行比較分析，結果發現：糖尿病合并頸動脈粥樣硬化組的血壓、血脂、體重指數、年齡及吸煙比例明顯高于對照組（P＜0.05）；而兩組間的性別構成相匹配（P＞0.05），差異無統計學意義。

2.3 遺傳平衡檢驗 將病例組和對照組的eNOS各基因型頻率代入 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，進行群體代表性檢驗，結果顯示eNOS各基因型頻率與期望值基本吻合，Waldχ2值分別為3.50和0.02，P＞0.05，基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2.4 eNOS基因a／b多態性與糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的關聯分析 糖尿病合并頸動脈粥樣硬化組（病例組）組與對照組的ab基因型頻率分別為15.21%和11.25%，兩者比較有顯著差異 （P＜0.05）。a等位基因頻率在病例組為9.78%，較對照組（6.04%）明顯偏高（P＜0.05）（見表1）。Logistic回歸分析顯示，4a等位基因與糖尿病合并頸動脈粥樣硬化具有顯著相關性 （OR＝1.594，95%CI 1.256～1.741，P＝0.000），a等位基因是糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的危險因素。

圖1 PCR擴增結果電泳圖譜

表1 eNOS基因型及等位基因頻率分布的比較

表2 糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的多因素logistic回歸分析

2.5 多因素條件logistic回歸分析 多因素logistic回歸分析去除血壓、血脂、體重指數、年齡及吸煙后，4a等位基因與頸動脈粥樣硬化仍相關 （OR＝0.717，95%CI＝0.547-0.987，P＝0.001）（見表2）。

3 討論

NO是體內重要的抗動脈粥樣硬化的分子［8］。NO半衰期很短，其生物合成完全依賴eNOS的催化，eNOS的表達直接關聯產生NO的量［9］。eNOS基因多態性可能影響eNOS蛋白的功能及活性，降低NO的合成，加速動脈粥樣硬化的發展，從而引發血栓形成及心腦血管疾?。?0］。TSUKADA等［11］研究發現27 bp VNTR多態性與基礎的內皮NO釋放水平有關，帶4a等位基因基礎的內皮NO釋放水平明顯低于不帶4a等位基因者。但是，WANG等［12］研究卻得出不同結論：eNOS基因第4內含子的VNTR多態性與eNOS酶功能活性有關，4a等位基因攜帶者eNOS酶活性比4b等位基因攜帶者高7倍，血漿NO水平明顯升高。eNOS基因多態性的效應可能最終要通過影響NO的生成來實現，但其具體機制還需要深入的研究。

Salimi等［13］研究發現eNOS基因第4內含子基因的多態性與冠狀動脈粥樣硬化有著密切聯系，而eNOS基因第4內含子基因的多態性與血漿中NO的水平無關。Fatini等［14］研究已經發現eNOS基因第4內含子的a等位基因為頸動脈粥樣硬化的危險因素。Fatma S等［15］研究亦認為：eNOS基因第4內含子的a等位基因可能為動脈粥樣硬化發病的獨立危險因素。Ji Hyun Park等［16］研究表明：在韓國人群中eNOS基因第4內含子的VNTR多態性與2型糖尿病合并頸動脈粥樣硬化有明顯相關性；eNOS基因第4內含子的a等位基因可能為糖尿病患者頸動脈粥樣硬化發病的獨立危險因素。此結論與本研究結果一致。

本研究結果發現：在漢族人群中糖尿病合并頸動脈粥樣硬化患者的a等位基因頻率高于對照組 （9.78%、6.04%），且差別有顯著區別；4a／4b＋4a／4a基因型頻率在糖尿病合并頸動脈粥樣硬化組和對照組分別為 17.38%和 11.65%（χ2＝5.518，P＜0.05），有統計學差異。用多元Logistic回歸分析校正了年齡、高血壓、高血脂、體重指數和吸煙等危險因素的影響后，a等位基因是糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的遺傳危險因素（P＝0.001，OR＝0.717）。證實eNOS基因VNTR多態性是影響漢族人群中糖尿病患者發生頸動脈粥樣硬化的獨立危險因素。同時我們還分析了一些臨床特征與糖尿病合并頸動脈粥樣硬化的關系，發現年齡、高血脂、吸煙和肥胖是在漢族人群中糖尿病合并頸動脈粥樣硬化發生的重要風險因子。

本研究首次報道了漢族人群中eNOS基因27 bp VNTR多態性為糖尿病合并頸動脈粥樣硬化發病的危險因素，但由于研究所選的樣本具有地域限制，不能代表整體人群。所以，eNOS基因27 bp VNTR多態性是否與糖尿病合并頸動脈粥樣硬化有密切關系還需多中心進一步研究。

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Association study between the polymorphisms of nitric oxide synthase gene and carotid atherosclerosis in type 2 diabetic in the Chinese Han population.

LU Ruichun， WANG Hao， YU Jintai， TAN Lan.Department of neurology，Qing Dao Municipal Hospital，Qingdao 266071，China.Tel：053－288905686.

Objective To investigate the association between 27-base pair repeats polymorphism in intron 4 of eNOS gene and carotid atherosclerosis in type 2 diabetic in the Chinese Han population. Methods The two polymorphisms were analyzed in 189 patients of carotid atherosclerosis in type 2 diabetic and 240 controls of Chinese origin using polymerase chain reaction and its products were directly sequenced. Results The eNOS4a allele distribution frequency of eNOS gene in carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group（9.78%）was higher than that in control group （6.04%）， and4a／4b＋4a／4a distribution frequency of eNOS gene in carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group （17.38%） was also higher than that in control group （11.65%）.Both differences between carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group and control group were significant（all P＜0.05）.Marker eNOS4a allele was found associated with carotid atherosclerosis in type 2 diabetic（OR＝1.594，95%CI＝1.256－1.741，P＝0.000）.After adjusted，a association was observed for eNOS4a allele using multivariate logistic regression analysis（P＝0.001，OR＝0.717）.Conclusions eNOS gene promoter polymorphisms are associated with ischemic stroke.the eNOS4a allele may rise the risk of carotid atherosclerosis in type 2 diabetic patients in the Chinese Han population.

Nitric oxide synthase Polymorphism Diabetes mellitus Carotid atherosclerosis

R743.3

A

2011－03－11）

（責任編輯：李立）

* 青島市市立醫院神經內科（青島 266071）

△ 青島大學醫學院附屬醫院

（Email：dr.tanlan＠163.com）