利用細(xì)胞染色體技術(shù)對苜蓿屬和胡盧巴屬親緣關(guān)系的鑒定

邢建軍，李志勇＊，蔡麗艷，常淑宏，劉磊，周國棟，2，解永鳳

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所農(nóng)業(yè)部沙爾沁牧草資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗(yàn)站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

染色體是遺傳物質(zhì)的載體，通過對體細(xì)胞染色體數(shù)目、大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)等的檢測可以了解屬間、種間的差異，可以作為牧草種質(zhì)資源鑒定和植物分類的依據(jù)。苜蓿屬（MedicagoL.）及其近緣屬植物胡盧巴屬（TrigonellaL.）都隸屬于豆科（Leguminosae）車軸草族（Trib.Trifolieae）的優(yōu)良牧草，在我國西部地區(qū)均有較大范圍的分布〔1〕。因其胡盧巴屬植物與苜蓿屬的一些植物種類在形態(tài)等各方面存在著相似，所以目前分類學(xué)上對苜蓿屬和胡盧巴屬間的界限劃分十分模糊。Lesins等〔2〕利用雜交試驗(yàn)和染色體分析，并以雜交成功與否作為種間親緣關(guān)系的依據(jù)，根據(jù)體細(xì)胞染色體數(shù)目和形態(tài)將兩個(gè)扁蓿豆種歸入苜蓿屬。Qurios等〔3〕將胡盧巴屬的Trigonellacretacea歸入苜蓿屬。E－.Small〔4〕根據(jù)苜蓿花的彈花機(jī)制，將胡盧巴屬中的20多個(gè)一年生胡盧巴種（Cermmon Fenupreek）歸入苜蓿屬。以上對胡盧巴屬和苜蓿屬的親緣關(guān)系的研究都是基于雜交試驗(yàn)和染色體分析，后來的研究有基于形態(tài)學(xué)、數(shù)量特征等等。鄧超宏等〔5〕通過對苜蓿屬和胡盧巴屬植物的形態(tài)特征及數(shù)量分類進(jìn)行研究，利用主成分分析表明：果實(shí)的長寬比、小葉的長寬比和花萼長等性狀對苜蓿屬與胡盧巴屬植物的分類具有重要意義，而且還推斷出利用苜蓿屬和胡盧巴屬植物花粉性狀的分類價(jià)值不大。

筆者對苜蓿屬的18個(gè)材料和胡盧巴屬的6個(gè)材料的體細(xì)胞染色體數(shù)目、平均臂比值和平均著絲粒指數(shù)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)分析，在細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)上了解苜蓿屬和胡盧巴屬的差異，判斷屬間和種間植物的親緣關(guān)系，為苜蓿屬和胡盧巴屬的育種等提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供，共24份，包括苜蓿屬18個(gè)材料（包括花苜蓿，即扁蓿豆7個(gè)材料）和胡盧巴屬6個(gè)材料，材料名稱及來源見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料及其采集地點(diǎn)

1.2 試驗(yàn)材料的取材

每個(gè)材料的生根條件按照種子發(fā)芽條件的標(biāo)準(zhǔn)，參見牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程〔6〕，待根尖長0.5～2.0 cm時(shí)上午9∶00～11∶00取材。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理

將待觀察的根尖放入0.002 mol／L.8－羥基喹啉中預(yù)處理約3.5 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料的固定

用卡諾氏（carnoy）固定液將預(yù)處理的材料進(jìn)行固定2～24 h后，70%乙醇溶液中保存。

1.5 實(shí)驗(yàn)材料的解離

將固定的根尖材料浸入1N Hcl溶液中，再放入恒溫60℃水浴5min，然后用蒸餾水洗凈。

1.6 染色和制片

取根尖分生組織，置于清潔載玻片上，滴少許品紅溶液染色，加上蓋玻片輕輕敲打壓片，用吸水紙吸去多余染液。

1.7 染色體觀察

染色體觀察用OLYMPUSBH－2型數(shù)碼顯微攝影儀拍照，并且觀測每個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)目。

1.8 染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)的分析

通過對供試材料根尖細(xì)胞染色體壓片的觀察，選擇其中50個(gè)分散良好的分裂中期的染色體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)目，并且用測量每條染色體的長臂和短臂的長度，再計(jì)算平均臂比值和平均著絲粒指數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用EXCEL和SAS 8.0軟件進(jìn)行基本參數(shù)和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的染色體

部分供試材料的染色體示意圖見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 1號材料托特菲爾德苜蓿（上）和4號材料蘭花苜蓿（下）居群的染色體數(shù)目

圖2 3號材料矩鐮莢苜蓿（上）和7號材料黃花苜蓿（下）居群的染色體數(shù)目

圖3 16號材料胡盧巴（上）和17號材料胡盧巴（下）居群的染色體數(shù)目

圖4 21號材料扁蓿豆（上）和22號材料扁蓿豆（下）居群的染色體數(shù)目

2.2 供試材料的染色體的相關(guān)參數(shù)

供試材料染色體的相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 各個(gè)供試材料的染色體的相關(guān)參數(shù)

所選研究材料中，苜蓿屬18個(gè)材料中共檢測出二倍體（2n＝2x＝16）材料15個(gè)（1、4、5、6、8、9、10，11號和7個(gè)扁蓿豆材料），四倍體（2n＝4x＝32）材料3個(gè)（2、3和7號材料）的2個(gè)倍性水平，染色體基數(shù)都為8；胡盧巴屬6個(gè)材料的均為二倍體，染色體組成為（2n＝2x＝16）染色體基數(shù)都為8。

2.3 供試材料的聚類分析

利用平均臂比值和平均著絲粒指數(shù)對所有材料進(jìn)行類平均法聚類分析，聚類圖結(jié)果見5。由圖5可見，通過染色體平均臂比值和平均著絲粒指數(shù)對所有材料進(jìn)行聚類分析，在歐式距離為0.6時(shí)，可以將所有材料分為4大類，第1大類包括3個(gè)材料，1、19和18號材料，均為苜蓿屬的材料；第2大類包括13個(gè)材料，苜蓿屬11個(gè)和胡盧巴屬2個(gè)材料；第3大類包括7個(gè)材料，4個(gè)苜蓿屬和3個(gè)胡盧巴屬的材料；第4大類包括1個(gè)材料，為胡盧巴屬的材料。

圖5 基于染色體平均臂比值和平均著絲點(diǎn)指數(shù)的聚類結(jié)果

3 討論

目前，對苜蓿屬和胡盧巴屬植物進(jìn)行系統(tǒng)的研究比較少，但是對某一個(gè)屬的植物研究的相對較多。王俊杰〔7〕通過對野生黃花苜蓿染色體數(shù)目與核型分析發(fā)現(xiàn)，供試材料共檢測出二倍體（2n＝2x＝16）和四倍體（2n＝4x＝32）的2個(gè)倍性水平，并且包含有M、m、sm和st 4種染色體類型。而李鴻雁〔8〕通過對苜蓿屬4份扁蓿豆材料研究表明：染色體數(shù)目均為2n＝2x＝16，都是二倍體，染色體長度在1－4μm之間，屬于小染色體，存在核型多型性。寧紅梅〔9〕等通過對苜蓿屬的野生黃花扁蓿豆染色體核型研究發(fā)現(xiàn)：野生黃花扁蓿豆與扁蓿豆的染色體數(shù)目相同，均為2n＝2x＝16，為二倍體。祁如虎〔10〕對3種胡盧巴屬植物的核型研究發(fā)現(xiàn)，其染色體數(shù)目2n＝2x＝16，分析了染色體的核型組成，并且指出了可能的演化程序。因此，通過系統(tǒng)對苜蓿屬和胡盧巴屬植物體細(xì)胞染色體數(shù)目、染色體核型組成等進(jìn)行研究，這樣可能更有利于苜蓿屬和胡盧巴屬植物親緣關(guān)系的鑒定，也為其他牧草種質(zhì)的鑒定提供科學(xué)的方法和理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從染色體數(shù)目和倍性水平分析可以得出，苜蓿屬的所有材料可以分為兩大類，分別為二倍體材料和四倍體材料（所有扁蓿豆材料均為二倍體2n＝2x＝16）；胡盧巴屬的所有材料均為二倍體，染色體組成為2n＝2x＝16。從染色體數(shù)目和倍性水平初步來看，胡盧巴屬植物與苜蓿屬的部分植物親緣關(guān)系較近，比如與所有苜蓿屬的扁蓿豆材料，1、4、5、6、8、9、10和11號的苜蓿材料。聚類分析結(jié)果表明：胡盧巴屬植物與苜蓿屬的扁蓿豆材料親緣關(guān)系更近，與苜蓿屬的其它材料親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。本研究利用體細(xì)胞染色體數(shù)目、倍性水平、平均臂比值和平均著絲粒指數(shù)對苜蓿屬18個(gè)材料和胡盧巴屬6個(gè)材料進(jìn)行初步了解和鑒定，至于這兩個(gè)屬的分類地位還須結(jié)合植物的形態(tài)學(xué)、染色體的形態(tài)和染色體的核型組成、DNA分子標(biāo)記等詳細(xì)的研究。

〔1〕耿華珠 .中國苜蓿〔M〕.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：10.24.

〔2〕Lesins KA，Lesins I.GenusMedicago（Leguminosae）.A Taxogenetic study〔M〕.W.Junk.The Eague，1979.

〔3〕Quiros C F et aI.Alfalfa genetic and evolution.In：Hanson A，et al.Alfalfa improvement.Agron.Monogr.ASA，CS－SA，and SSSA，Madison，WI.1988.29.

〔4〕Small E..Polythetic generic separation in tribeTrifolieaesubtribeTrigolinae（Leguminosae）〔J〕.Can.J.Bot.1989，67：1480－1492.

〔6〕中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) .牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程〔S〕.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

〔7〕王俊杰 .中國黃花苜蓿野生種質(zhì)資源研究〔D〕.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

〔8〕李鴻雁 .扁蓿豆種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究〔D〕.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

〔9〕寧紅梅，米福貴，李鴻雁，等 .野生黃花型扁蓿豆染色體核型分析〔J〕.草地學(xué)報(bào)，2008，16（3）：316－318.

〔10〕祁如虎 .三種胡盧巴屬植物的核型比較〔J〕.中國草地，1997，（4）：52－54.