膠質瘤1p／19q聯合缺失特征分析

賽克王芳牟永告張湘衡柯超楊群英邵建永陳忠平

·論 著·

膠質瘤1p／19q聯合缺失特征分析

賽克*王芳△牟永告*張湘衡*柯超*楊群英*邵建永△陳忠平*

目的 研究膠質瘤中 1p／19q聯合缺失與患者臨床特征及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）表達的關系。方法 使用熒光原位雜交技術，對中山大學附屬腫瘤醫院2009年3月至2011年3月的63例手術確診膠質瘤標本進行1p／19q聯合缺失檢測，利用統計學方法分析1p／19q聯合缺失患者與無聯合缺失患者在性別、年齡、部位、病理類型及MGMT表達狀態是否有差異。結果 全組63例患者，男38例，女25例，年齡（41.7±15.3）歲。其中，16例（25.4%）存在1p／19q聯合缺失。1p／19q聯合缺失患者與無聯合缺失患者在性別、年齡及腫瘤部位間的差異無統計學意義。各病理類型1p／19q聯合缺失的比例從高到低依次為少突膠質細胞瘤（9／16）、間變性少突膠質細胞瘤（3／8）、星形細胞瘤（2／10）、間變性星形細胞瘤（1／6）及膠質母細胞瘤（1／21），其差異有統計學意義（P＜0.01）。在全組63例膠質瘤及25例含少突成分膠質瘤中，MGMT陽性腫瘤1p／19q聯合缺失比例與MGMT陰性組間的差異皆無統計學意義。結論1p／19q聯合缺失主要與膠質瘤的病理類型有關，含少突成分膠質瘤中1p／19q聯合缺失比例較高。1p／19q聯合缺失可作為少突膠質細胞瘤病理診斷的重要參考指標。

膠質瘤 1p／19q聯合缺失 MGMT 病理

膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的原發腫瘤，準確的病理診斷是合理治療的前提。尋找特異性的分子指標用于膠質瘤病理診斷以及預測膠質瘤患者的臨床預后，是目前神經腫瘤領域內的研究熱點。1號染色體短臂（1p）與19號染色體長臂（19q）的聯合性缺失是膠質瘤，尤其是少突膠質細胞瘤重要的分子指標，在病理診斷、放化療療效評價及臨床預后預測具有重要意義［1－2］。目前，熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是國外最常用于檢測臨床膠質瘤標本中1p／19q聯合缺失的手段［3］。我們用FISH檢測我院2009年3月至2011年3月膠質瘤中1p／19q聯合缺失的結果，并分析與其相關的臨床病理因素，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究收集2009年3月至2011年3月我院病理確診，并進行1p／19q聯合缺失檢測的膠質瘤病例63例。本組63例，男38例，女25例，年齡7～76歲，平均（41.7±15.3）歲。腫瘤部位：脊髓2例，小腦2例，丘腦2例，島葉3例，額葉25例，顳葉14例，頂葉9例，枕葉6例。腫瘤病理類型：毛細胞型膠質細胞瘤1例，星形細胞瘤10例，少突膠質細胞瘤16例，間變性星形細胞瘤6例，間變性少突膠質細胞瘤8例，間變性少突－星形細胞瘤1例，膠質母細胞瘤21例。腫瘤級別（WHO分級）：Ⅰ級1例，Ⅱ級26例，Ⅲ級15例，Ⅳ級21例。

1.2 O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）蛋白表達檢測 采用四川宇康生物技術有限公司生產的甲基轉移酶診斷試劑盒檢測。檢測方法按試劑盒說明書進行。結果判定根據顯微鏡下觀察，在腫瘤細胞細胞核或胞漿內有棕褐色著色顆粒的為陽性，其中呈強著色、陽性細胞大于10%為陽性。

1.3 1p／19q聯合缺失檢測 石蠟包埋甲醛固定腫瘤組織，切片HE染色。于光鏡下選取無出血及壞死之腫瘤區域，并于石蠟塊相應位置定位。使用美國雅培公司生產的1p／19q熒光探針試劑盒，分別在兩片選取的石蠟玻片上標記1p36（紅色靶點探針）、1q25（綠色參照探針）與19q13（紅色靶點探針）、19p13（綠色參考探針）。檢測方法按說明書進行。DAPI（藍色）標記細胞核。熒光顯微鏡下觀察。選取100個腫瘤細胞，當細胞核內紅色信號數目＝綠色信號數目，判定為非缺失細胞；當細胞核內紅色信號數目＜綠色信號數目時，判定為缺失細胞。當缺失細胞比例＞30%時，判定該腫瘤標本為1p36缺失或19q13缺失陽性（圖1）。

圖1 熒光原位雜交檢測膠質瘤1p／19q聯合缺失。A：1p無缺失；B：19q無缺失；C：1p缺失；D：19q缺失。在A與C中，紅色信號為1p探針，綠色信號為1q探針。在B與D中，紅色信號為19q探針，綠色信號為19p探針。

1.4 統計學分析 使用SPSS 10.0進行分析，t檢驗行計量資料間的比較，χ2檢驗行計數資料間的比較。檢測水準α＝0.05。

2 結果

2.1 1p／19q聯合缺失在膠質瘤中構成情況 見表1。本組 63例膠質瘤中，1p／19q聯合缺失 16例（25.4%），無聯合缺失47例（74.6%）。聯合缺失組中男11例，女5例；無聯合缺失組中男27例，女20例，兩組性別差異無統計學意義 （χ2＝0.637，P＞0.05）。聯合缺失組與非聯合缺失組年齡分別為（38.1±14.1）歲及（42.9±15.7）歲，兩組年齡差異無統計學意義（t＝2.000，P＞0.05）。聯合缺失組腫瘤位于左側8例，右側7例；非聯合缺失組左側24例，右側22例，兩組腫瘤側別差異無統計學意義（χ2＝0.061，P＞0.05）。兩組腫瘤所在部位的差異亦無統計學意義（χ2＝1.802，P＞0.05）

2.2 1p／19q聯合缺失與膠質瘤病理類型及病理級別的關系 見表2。16例1p／19q聯合缺失病例中，星形細胞瘤2例，少突膠質細胞瘤9例，間變星形細胞瘤1例，間變少突細胞瘤3例，膠質母細胞瘤1例。其中，含少突成分病例12例，不含少突成分4例；低級別膠質瘤（Ⅰ、Ⅱ級）11例，高級別膠質瘤（Ⅲ、Ⅳ級）5例。47例無1p／19q聯合缺失病例中，毛細胞型星形細胞瘤1例，星形細胞瘤8例，少突膠質細胞瘤7例，間變星形細胞瘤5例，間變少突細胞瘤5例，間變少突-星形細胞瘤1例，膠質母細胞瘤20例。其中，含少突成分病例13例，不含少突成分34例，低級別膠質瘤（WHO分級Ⅰ、Ⅱ級）16例，高級別膠質瘤（WHO分級Ⅲ、Ⅳ級）31例。1p／19q聯合缺失組中含少突成分膠質瘤的比例（12／16）高于無聯合缺失組（13／47）（χ2＝11.18，P＜0.05）。各病理類型中1p／19q聯合缺失的比例從高到低依次為少突膠質細胞瘤（9／16）、間變性少突膠質細胞瘤（3／8）、星形細胞瘤（2／10）、間變性星形細胞瘤（1／6）及膠質母細胞瘤（1／21），1p／19q聯合缺失的比例在各病理類型間的差異有統計學意義（χ2＝13.199，P＜0.05）。各病理級別中1p／19q聯合缺失的比例從高到低依次為Ⅱ級（11／26）、Ⅲ級（4／15）及Ⅳ級（1／21），1p／19q聯合缺失的發生率在各級別間的差異有統計學意義（χ2＝8.983，P＜0.05）。

2.3 1p／19q聯合缺失與膠質瘤組織中MGMT表達的關系 見表3。全組63例膠質瘤中MGMT陰性29例，陽性34例。MGMT陰性腫瘤中1p／19q聯合缺失9例，無缺失20例；MGMT陽性腫瘤中1p／19q聯合缺失7例，無缺失27例。全組MGMT陰性與陽性腫瘤中1p／19q聯合缺失比例的差異無統計學意義（χ2＝0.901，P＞0.05）。在含少突成分的25例膠質瘤中，MGMT陰性13例，陽性12例。MGMT陰性腫瘤中1p／19q聯合缺失7例，無缺失6例；MGMT陽性腫瘤中1p／19q聯合缺失5例，無缺失7例。含少突成分膠質瘤MGMT陰性與陽性腫瘤中1p／19q聯合缺失比例的差異無統計學意義（χ2＝0.370，P＞0.05）。

表1 1p／19q聯合缺失與1p／19q無缺失患者臨床特征比較

表2 兩組患者病理類型比較

3 討論

3.1 1p／19q聯合缺失的檢測方法 目前文獻報道較多的用于檢測1p／19q聯合缺失的方法主要包括基于PCR的微衛星分析、比較基因組雜交及熒光原位雜交（FISH）。前兩項技術由于耗時長、過程復雜及對技術設備要求較高，因此多用于科研使用，較少用于臨床，而FISH由于具有商業化試劑盒、操作相對簡單及結果直觀等優點，在國外已廣泛應用于臨床工作［4］。

表3 不同MGMT表達組間1p／19q聯合缺失的比較

3.2 1p／19q聯合缺失與膠質瘤病理類型 Reifenberger J等［5］最早發現少突膠質細胞瘤中存在較高頻率的1p／19q的聯合缺失。隨后研究［6］也表明，1p／19q聯合缺失在少突膠質瘤中常見，發生率可達50%～80%，而在星形細胞瘤中，出現率較低。在病理診斷方面，正是由于1p／19q聯合缺失在少突膠質細胞瘤與星形細胞瘤存在顯著差異，檢測1p／19q聯合缺失有助于形態學表現不典型少突膠質細胞瘤的診斷與鑒別。與文獻報道相符，在本組16例1p／19q聯合缺失的病例中，含少突成分的膠質瘤有12例，而47例無1p／19q聯合缺失組中，含少突成分的膠質瘤僅有13例。在各病理類型中，含少突成份膠質瘤中1p／19q聯合缺失的比例明顯高于不含少突成分膠質瘤，其比例從高到低依次為少突膠質細胞瘤＞間變性少突膠質細胞瘤＞星形細胞瘤＞間變性星形細胞瘤＞膠質母細胞瘤。

3.3 1p／19q聯合缺失與少突膠質細胞瘤患者預后及MGMT表達的關系 1p／19q聯合缺失是少突膠質細胞瘤化療敏感性及預后的重要預測指標。1998年，Cairncross等在回顧性分析了PCV化療方案治療間變性少突膠質細胞瘤的療效后發現，具有1p／19q聯合缺失的腫瘤對PCV化療方案的反應率為100%，而僅有25%的無1p／19q聯合缺失的腫瘤對PCV化療方案有反應。無1p／19q聯合缺失患者在PCV方案化療后的復發死亡率是具有聯合缺失患者的5.7倍［7］。除PCV方案外，具有1p／19q聯合缺失的少突膠質細胞腫瘤對替莫唑胺（temozolomide，TMZ）亦有較高的反應率。在一項前瞻性臨床研究中，Brandes等發現具有1p／19q聯合缺失的間變或復發少突膠質細胞瘤中，59.4%的腫瘤對TMZ敏感，而僅有34.3%的無聯合缺失的腫瘤對TMZ敏感。另外，具有聯合缺失患者中位生存期為45.3個月，較無缺失患者的18.8個月明顯延長［8］。

MGMT能夠修復由化療藥物造成的DNA損傷，是膠質瘤中介導常用烷化劑（如亞硝脲及替莫唑胺）耐藥的重要原因［9］。在膠質瘤中，MGMT的表達與否主要受其啟動子區域甲基化狀態的調控：若啟動子區域甲基化，則MGMT不表達或低表達；若啟動子區域去甲基化，則MGMT高表達［10］。由于1p／19q聯合缺失的少突膠質瘤對含烷化劑的PCV化療方案及TMZ敏感，故有部分學者猜測，這些腫瘤的化療敏感性可能與MGMT有關。在一項歐洲癌癥治療研究組織 （EORTC）進行的臨床研究中，van den Bent等發現在39例1p／19q聯合缺失的間變性少突膠質細胞瘤中，38例（97%）腫瘤存在MGMT啟動子區域甲基化［11］。國內任曉輝利用FISH及免疫組化分別檢測膠質瘤標本中1p／19q聯合缺失及MGMT的表達情況，并進行相關性分析。該研究作者發現，單因素及多因素回歸分析都表明MGMT的表達水平與1p／19q聯合缺失相關，并提出利用膠質瘤病理類型及MGMT表達水平預測1p／19q的缺失狀態［12］。但是，1p／19q聯合缺失與MGMT表達的關系，以及1p／19q聯合缺失腫瘤化療敏感性與較好預后是否與MGMT表達水平有關，仍存在爭議。Watanabe等報道47%的少突膠質細胞瘤表達MGMT，且MGMT的表達與1p／19q聯合缺失無明顯關聯［13］。與此篇文獻相似，在本組63例膠質瘤及25例含少突成分膠質瘤中，MGMT陽性表達率分別為54.0%與48.0%。兩組中，MGMT陽性與陰性病例1p／19q聯合缺失率的差異都不具有統計學意義。因此，1p／19q聯合缺失少突膠質細胞瘤化療敏感及患者預后較好可能尚有其他機制。已有研究表明，在1p及19q上存在多個與腫瘤發生、進展及治療抗拒相關的基因，如Notch2、DIRAS3、CITED4及EMP3等［14］。1p／19q聯合缺失可導致相關蛋白表達量的下降、腫瘤生物學特性的改變，從而最終影響患者的臨床預后。1p／19q聯合缺失在少突膠質細胞瘤生物學特性中所起的作用及與MGMT表達間的關系仍需要進行深入的研究。

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Analysis of 1p／19q Codeletion in Gliomas： Report of 63 Cases.

SAI Ke， WANG Fang， MOU Yong-gao，ZHANG Xiangheng，KE Chao，YANG Qunying，SHAO Jianyong，CHEN Zhongping.Department of Neurosurgery，Sun Yat-sen University Cancer Center，651 Dongfeng Road East，Guangzhou 510060.Tel：020－87343309.

Objective To detect 1p／19q codeletion in patients with gliomas and investigate the relationship between 1p／19q codeletion and other clinical features including age， sex， location of tumors and the expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase（MGMT）.Methods Fluorescence in situ hybridization（FISH）was used to detect 1p／19q codeletion in 63 cases with pathologically confirmed gliomas in Sun Yat-sen University from March 2009 to March.Clinical data were retrospectively reviewed. The relationship between 1p／19q codeletion and other clinical features including age，sex，location of tumors and the expression of MGMT was analyzed.Results Among 63 patients，38 were male and 25 were female.The mean age of patients was 41.7 years.Codeltion of 1p／19q was detected in 16 cases（25.4%）.There were no statistical differences in sex， age and tumor location between glioma patients with and without 1p／19q codeletion.Codeletion of 1p／19q，in an descend order，was detected in oligodendrogliomas（9／16），anaplastic oligodendrogliomas（3／8），astrocytomas（2／10），anaplastic astrocytomas（1／6）and glioblastoma multiforme（1／21）.There were statisticaldifferencesinthedistributionof1p／19qindifferentpathologicaltypes（P＜0.01）.Among63cases，34wereMGMT-positive and 29 were MGMT-negative.No statistical differences of status of 1p and 19q codeletion were found between MGMT-positive and-negative tumors.Conclusions 1p／19q codeletion is associated with oligodendroglial tumors and is a useful marker for pathological diagnosis.

Glioma 1p／19q codeletion MGMT Pathology

R651

A

2011－05－16）

（責任編輯：甘章平）

* 華南腫瘤學國家重點實驗室 中山大學腫瘤防治中心神經外科（廣州 510060）

（E-mail：chenzhp＠sysucc.org.cn）

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