十二指腸灌注亮氨酸對山羊胰腺外分泌功能的影響

于紅霞 于志鵬 劉 凱 姚軍虎 徐 明

(西北農林科技大學，楊凌 712100)

十二指腸灌注亮氨酸對山羊胰腺外分泌功能的影響

于紅霞 于志鵬 劉 凱 姚軍虎*徐 明*

(西北農林科技大學，楊凌 712100)

本試驗旨在研究十二指腸灌注亮氨酸(leucine，Leu)對山羊胰腺外分泌及血漿指標的影響，進而為提高反芻動物小腸淀粉利用率提供理論依據。本研究采用4×4拉丁方試驗設計，選用4只周歲齡關中奶山羊，手術安裝十二指腸瘺管、總膽管插管，進行十二指腸Leu灌注試驗(灌注水平分別為0、3、6、9 g/d)，研究Leu不同灌注水平對胰腺外分泌功能、血漿葡萄糖及胰島素濃度的影響。結果表明:十二指腸灌注Leu，血漿中的葡萄糖和胰島素含量、胰液分泌量、胰液總蛋白質濃度及合成速率、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的分泌均不受影響(P＞0.05)。隨Leu灌注水平的提高，胰腺α－淀粉酶的分泌濃度差異不顯著(P＞0.05)，而分泌速率呈先升高后降低再回升的變化規律(P＜0.05)。結果提示，Leu可不依賴于胰島素直接長期調控山羊胰腺α－淀粉酶的分泌。

亮氨酸;奶山羊;十二指腸灌注;胰腺外分泌;胰島素

淀粉是高生產性能反芻動物最主要的能量來源。在奶畜的泌乳初期，由于采食量下降而不能滿足因泌乳水平升高而增加的能量需求，使奶畜常處于能量負平衡狀態。生產中為解決這一問題，不斷地增加飼糧中精飼料(主要是淀粉)的含量，使更多的淀粉到達小腸。淀粉在反芻動物小腸最終被降解為葡萄糖，其能量利用效率比在瘤胃中發酵高42%［1］，但小腸消化淀粉的能力是有限的。有研究表明，隨著十二指腸淀粉灌注水平的提高，淀粉在小腸的消化量隨之增加，但消化率卻隨之下降［2］，進入奶牛十二指腸的淀粉平均只有 67.6% 在小腸中被消化［3］。Harmon 等［4］研究指出胰腺α－淀粉酶分泌量不足是限制反芻動物小腸淀粉利用的關鍵因素。目前，營養物質對胰腺消化酶合成的調控機制仍不清晰，但可從轉錄水平和翻譯水平調控蛋白質的合成，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信號通路是翻譯水平上調控蛋白質，如肌肉蛋白［5－6］、乳蛋白［7－8］和胰腺蛋白［9］合成的主要途徑。單胃動物長期飼養試驗表明，高蛋白質飼糧雖增強m TOR信號通路，但降低胰腺α－淀粉酶的mRNA豐度，導致胰腺α－淀粉酶的分泌量下降［10］。而對于反芻動物，增加飼糧粗蛋白質濃度，提高到達小腸的粗蛋白質含量，可增加胰腺α－淀粉酶mRNA的豐度和分泌［11］。這表明胰腺 α－淀粉酶的分泌量與其mRNA豐度呈正相關，蛋白質可影響m TOR信號通路或胰腺 α－淀粉酶mRNA豐度，調控胰腺α－淀粉酶的分泌，且其調控作用在單胃動物和反芻動物中存在差異。另有研究報道，在單胃動物長期飼養試驗中，支鏈氨基酸抑制胰腺α－淀粉酶的分泌，尤其是亮氨酸(Leu)是最主要增強m TOR信號通路和降低胰腺α－淀粉酶mRNA豐度和分泌的飼糧因素［10，12］。而Leu對反芻動物胰腺 α －淀粉酶分泌的影響與單胃動物是否存在種間差異仍不清楚。因此，本試驗旨在研究十二指腸灌注Leu對山羊胰腺外分泌(主要是α－淀粉酶)及血漿指標的影響，為提高小腸淀粉消化率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼糧

選用4只健康無病、體況相近的周歲齡關中奶山羊母羊［(30.1±1.3)kg］，試驗飼糧參照NRC(1981)奶山羊飼養標準設計，由54.21%玉米青貯和45.79%精料補充料組成(干物質基礎)，每天飼喂量為722 g干物質。精料補充料組成及營養水平見表1。

表1 精料補充料組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate supplement(DM basis)

1.2 試驗設計與方法

本試驗采用4×4拉丁方試驗設計，手術安裝十二指腸瘺管、總膽管插管(引流管和回流管)［14］，進行十二指腸Leu灌注試驗(灌注水平分別為 0、3、6、9 g/d)，每個灌注期為 14 d，其中后4 d為樣品收集期，休息期為10 d。

灌注液量為500 m L/d，灌注方法為將Leu溶解于自來水至500 m L，水浴調溫至37℃，用恒流泵(BT100－12，河北保定申辰泵業有限公司)經十二指腸瘺管恒速注入，灌注過程中不斷攪動，速度為0.35 m L/m in，每日連續灌注24 h。灌注期前3 d為適應期，灌注量分別為25%、50%、75%，第4天開始進行100%灌注。

1.3 飼養管理

飼養試驗于西北農林科技大學生態養殖場進行，代謝籠(0.75 m ×1.50 m ×1.35 m)中單籠飼養，為保證胰酶活性，室溫維持在5～10℃。試驗初期稱重，據體重調整采食量，試驗飼糧以全混飼糧形式投喂，飼糧每日按比例配制，等分為2份，分別于08:00和18:00給飼。自由飲水。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 胰液外分泌指標

于采樣期(4 d)每天連續采樣6 h，采樣時間分別為 09:00～14:00、15:00～20:00、21:00～02:00、03:00～08:00。每天于采樣前2 h連引流袋于總膽管插管引流管，以收集胰液。采樣前1 h，用50 m L無菌注射器將全部胰液經總膽管插管回流管注入體內，采樣時間內每隔1 h采集胰液，記錄體積，并取樣10%，其余經總膽管插管回流管注入體內。每天結束將每小時樣品等量混勻為1重復，－80℃保存備用。

1周內分析胰液總蛋白質含量以及α－淀粉酶、脂肪酶(試劑盒;南京建成生物工程研究所，南京)、胰蛋白酶［13］和糜蛋白酶［14］活性。其中，胰蛋白酶和糜蛋白酶需由腸激酶(100 U/L)激活后測定。

100 m L胰液中的淀粉酶在37℃與底物作用30 m in，水解10 mg淀粉為1個活性單位;1國際單位(U)的酶活性(胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶)相當于每分鐘釋放1μmol的產物。

1.4.2 血漿指標

采樣與胰液同步，采樣前安裝頸靜脈血插管，每隔1 h頸靜脈采血5 m L，肝素抗凝(500 IU/m L)，離心(1 800 r/m in，4 ℃)25 m in，取上層血漿，抑肽素抗降解(10 000 IU/m L)，每天結束后將血漿等量混勻，－80℃保存備用。

胰島素放射免疫試劑盒由北京北方生物技術研究所提供;血漿葡萄糖采用U－3900紫外可見分光光度計測定。

1.5 數據處理

試驗數據采用SPSS 17.0統計軟件的GLM模塊進行方差分析，Duncan氏法多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

由表2可知，十二指腸灌注Leu，胰液分泌量、胰液總蛋白質濃度及合成速率、胰蛋白酶、脂肪酶和糜蛋白酶的分泌均不受影響(P＞0.05)。隨Leu灌注水平的提高，胰液α－淀粉酶的分泌濃度差異不顯著(P＞0.05)，合成速率呈先升高后降低再回升的變化規律(P＜0.05)。各處理頸靜脈血漿中的葡萄糖和胰島素含量差異不顯著(P＞0.05)。

表2 十二指腸灌注Leu對山羊胰腺外分泌及血漿葡萄糖和胰島素水平的影響Table 2 Effect of duodenal infusion of Leu on pancreatic exocrine secretion and levels of plasma insulin and glucose lovels in goats

3 討論

十二指腸灌注Leu，各處理的胰液分泌量［(61.00 ±1.62)m L/h］及其總蛋白質濃度［(7.13±0.20)mg/m L］差異不顯著。Walker等［15］及后期的幾個試驗顯示，閹牛胰液的平均分泌速率為0.55～0.59 m L/(kg BW· h)。本試驗奶山羊胰液分泌速率為2.03 m L/(kg BW·h)，高于Walker等的研究結果，這可能與單位體重奶山羊代謝率較高有關。

胰腺可分泌α－淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶，負責小腸養分的消化。反芻動物胰腺α－淀粉酶分泌不足限制了小腸淀粉的利用［4］。過瘤胃酪蛋白刺激胰腺α－淀粉酶的分泌，但不影響胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌［16］。單胃動物飼糧支鏈氨基酸(Leu)降低了胰腺α－淀粉酶的活性(U/mg prot)［10，12］。 本 試 驗 中，十 二 指 腸 灌 注Leu，胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性、α－淀粉酶的分泌濃度(U/L和U/g prot)均不受影響，但隨Leu灌注水平的升高，其胰腺α－淀粉酶的合成速率(U/h)呈先升高后降低再回升的變化規律，表明不同灌注水平Leu調控胰酶分泌的效果不同，此差異可能與其調控方式有關。

有研究報道，單胃動物長期飼養試驗表明，高蛋白質飼糧可降低胰腺α－淀粉酶的mRNA豐度和分泌［10］;另有研究表明，過瘤胃灌注酪蛋白［17］或增加反芻動物飼糧粗蛋白質濃度以提高到達小腸的粗蛋白質含量［11］，可增加胰腺 α－淀粉酶mRNA豐度及其分泌量。以上研究結果表明α－淀粉酶的分泌量與其mRNA豐度呈正相關，蛋白質可在轉錄水平上調控胰腺α－淀粉酶的分泌，且在單胃動物和反芻動物中存在差異的主要原因可能為蛋白質對α－淀粉酶mRNA豐度的影響不同。單胃動物長期飼養試驗結果表明，支鏈氨基酸，尤其是Leu降低胰腺α－淀粉酶mRNA豐度，抑制胰腺 α － 淀粉酶的分泌［10，12］。若假設Leu對胰腺α－淀粉酶的分泌調控亦存在種間差異，在反芻動物長期飼養試驗中可能會增加胰腺α－淀粉酶mRNA豐度，刺激胰腺α－淀粉酶的分泌，與本試驗Leu灌注水平在0～3或6～9 g/d范圍內升高時，胰腺α－淀粉酶的合成速率線性增加的結果一致。但灌注水平為3～6 g/d時，其合成速率線性降低，原因可能與m TOR信號通路的調控有關。

m TOR信號通路主要包含上游信號通路［磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和結節性硬化復合物1/2(TSC1/2)］和下游信號通路［真核起始因子連接蛋白1(4E-BP1)和核糖體S6激酶1(S6K1)］。支鏈氨基酸可以通過磷酸化m TOR激活下游信號通路或直接磷酸化4E-BP1和S6K1，進一步激活mRNA翻譯起始和延伸階段［18］。同時m TOR信號通路的過度激活可以負反饋抑制上游 PI3K/AKT信號通路的激活［12］。灌注水平為3～6 g/d Leu可能負反饋抑制m TOR上游信號通路的激活，最終使胰腺α－淀粉酶分泌速率線性降低。

氨基酸(Arg、Lys、Leu)可直接刺激胰島素的分泌;亦可通過增加葡萄糖或生長激素的分泌間接地刺激胰島素的分泌。胰島素可激活m TOR信號通路及其下游信號分子，調控胰腺α－淀粉酶的分泌活性;亦可影響胰腺α－淀粉酶mRNA豐度，進而影響胰腺α－淀粉酶的分泌［11］。

胰島素在調控胰腺α－淀粉酶的分泌過程中起著重要的作用。但患有糖尿病的山羊灌注胰島素，胰腺α－淀粉酶分泌不能恢復正常［19］，Swanson等［17］在肉牛真胃灌注試驗中，發現玉米水解淀粉和酪蛋白均可增加胰島素的分泌，但對胰腺α－淀粉酶的分泌影響卻得到相反的結果。以上試驗說明反芻動物對胰腺α－淀粉酶的分泌調控可能不依賴于胰島素，支持本試驗結果，通過十二指腸灌注不同水平亮氨酸，胰腺α－淀粉酶的分泌速率差異顯著，但血液胰島素和葡萄糖濃度不受其影響，因此在本試驗中，胰島素不參與Leu對胰腺α－淀粉酶的調控作用。

這與單胃動物長期飼養試驗結果一致，Sans等［9］試驗指出Leu可不依賴于胰島素直接通過m TOR信號通路調控胰腺α－淀粉酶mRNA的表達。Hashimoto等［12］試驗指出小鼠采食高支鏈氨基酸(Leu)飼糧7 d，胰腺α－淀粉酶分泌降低，但血液胰島素含量不變。同時本課題組短期十二指腸Leu灌注試驗(數據未公布)也發現Leu可短期刺激胰島素的分泌。短期和長期飼養試驗結果不一致，原因可能為在長期灌注試驗中，動物產生適應性調節，使血液葡萄糖和胰島素水平處于穩態。

4 結論

Leu可不依賴于胰島素直接長期調控山羊胰腺α－淀粉酶分泌。

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*Corresponding author，YAO Junhu，professor，E-mail:yaojunhu2004@sohu.com;XU Ming，lecturer，E-mail:xum ing16899@sina.com

(編輯 趙天章)

Infusion of Leucine into Duodenum A ffects Pancreatic Exocrine Secretion of Goats

YU Hongxia YU Zhipeng LIU Kai YAO Junhu*XU Ming*
(College of Animal Science＆Technology，Northwest A＆F University，Yangling712100，China)

The experiment was conducted to investigate the effect of duodenal infusion of leucine(Leu)on pancreatic exocrine secretion and plasma indices in goats.Four one-year-old goats ［(30.1 ±1.3)kg］fitted with duodenal fistulas and common bile duct cannulaswere used in a 4×4 Latin square design.Each goat

four treatments:infusion of 0，3，6 and 9 g/d Leu into duodenum，respectively.The results showed that duodenal infusion of Leu didn’t affect concentrations of glucose and insulin in plasma，total pancreatic juice secretion，total protein concentration and production rate in pancreatic juice，and activities of trypsin，chymotrypsin，lipase and pancreaticα-amylase(P＞0.05).However，the secretion rate of pancreatic α-amylase was increased when the infusion level of Leu was 3 or 9 g/d(P＜0.05).The results indicate that Leu can directly long-term regulate the secretion of pancreatic α-amylase independent of insulin in goats.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1513-1518］

leucine;goat;duodenal infusion;pancreatic exocrine;insulin

S826

A

1006-267X(2011)09-1513-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.009

2011－04－11

國家自然科學基金(31001021);科技部國際科技合作與交流專項(2010DFB34230);陜西省‘13115’科技創新工程工程技術研究中心(2010ZDGC-02)、重大科技專項(2009ZDKG-18);陜西省農業攻關項目(2009K01-02)。

于紅霞(1986—)，女，山東泰安人，碩士研究生，從事動物營養與飼料科學研究。E-mail:yuhongxia.cool@163.com

*通訊作者:姚軍虎，教授，博士生導師，E-mail:yaojunhu2004@sohu.com;徐 明，講師，E-mail:xum ing16899@sina.com