長期投喂黃芪多糖對黃顙魚抗氧化及非特異性免疫指標的影響

白東清 吳 旋 郭永軍 朱國霞 邢克智 寧 博

(天津農學院水產科學系，天津市水產生態及養殖重點實驗室，國家級實踐教學示范中心，天津 300384)

長期投喂黃芪多糖對黃顙魚抗氧化及非特異性免疫指標的影響

白東清 吳 旋 郭永軍 朱國霞 邢克智*寧 博

(天津農學院水產科學系，天津市水產生態及養殖重點實驗室，國家級實踐教學示范中心，天津 300384)

本文旨在探討添加不同水平的黃芪多糖(astraglus polysaccharides，APS)對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)抗氧化及非特異性免疫指標的影響。選取2齡健康黃顙魚540尾，隨機分成6組，每組3個重復，每個重復30尾魚，分別投喂在基礎飼料中添加0(對照組)、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg黃芪多糖的試驗飼料，試驗期為8周。于試驗結束后測定黃顙魚體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)與溶菌酶(LSZ)活力，丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量，吞噬細胞的吞噬百分比(PP)、吞噬指數(PI)以及疾病抗性等指標。結果表明:與對照組相比，300 mg/kg組頭腎中以及600、900 mg/kg組肌肉中SOD活力分別提高1.61、1.95與2.08倍，差異顯著(P＜0.05);600～1 500 mg/kg黃芪多糖能顯著提高黃顙魚心臟、肝臟、脾臟、肌肉與鰓中的CAT活力(P＜0.05)，且各添加組的頭腎與中腎中CAT活力均顯著升高(P＜0.05);300～1 500 mg/kg組肝臟與脾臟中，600～1 500 mg/kg組心臟、頭腎、中腎、肌肉與鰓中的MDA含量與對照組相比顯著降低(P＜0.05)。各添加組的心臟、肝臟、脾臟與頭腎中以及600～1 500 mg/kg組的頭腎與中腎中 NO含量均顯著低于對照組(P＜0.05)。在0～1 200 mg/kg范圍內黃芪多糖添加水平與LSZ活力成正比，所有組織內LSZ活力較對照組均有顯著性地提高(P＜0.05)。隨黃芪多糖添加水平的升高，吞噬百分比與吞噬指數顯著升高(P＜0.05)。黃芪多糖可降低遲鈍愛德華氏菌攻毒后魚的死亡率，提高免疫保護率，尤其是1 200、1 500 mg/kg組，免疫保護率均達到50.0%。由此得出，在飼料中添加適宜水平的黃芪多糖可促進黃顙魚抗氧化功能的提升;飼料中添加黃芪多糖可促進黃顙魚非特異性免疫功能的提高，且以1 200 mg/kg添加水平的效果最佳。

黃顙魚;黃芪多糖;抗氧化指標;非特異性免疫指標

為適應人們生活水平的不斷提高，水產養殖規模呈現逐年擴大的態勢，但隨之而來卻是養殖動物疾病的大規模爆發。中草藥及其提取物已經成為了代替抗生素，治療、預防水產動物疾病的首選藥物。黃芪作為一種多年生草本補益類中藥，具有味甘、性溫，具有補氣升陽、固表止汗、托毒排膿和生肌等功效［1］。黃芪多糖(astraglus polysaccharides，APS)是從黃芪中提取的天然活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調節機體體液免疫、激活免疫細胞因子等功效［2］。目前，黃芪多糖以其顯著的免疫增強、抗病毒作用，加之價格低廉、來源豐富、毒性低、無耐藥性等［3］特性廣泛的應用于臨床醫療、畜牧及水產動物的養殖中。黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是一種小型的淡水經濟魚類，具有較高的營養及經濟價值，但近年來各種疾病的爆發成為了制約黃顙魚養殖業高速發展的主要因素。因此，本研究通過在飼料中添加不同水平的黃芪多糖，探討長期投喂黃芪多糖對黃顙魚抗氧化及非特異性免疫指標的影響，為黃芪多糖在水產養殖業中的長期應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

自天津農學院養殖漁場選取2齡健康黃顙魚540尾，平均體重(61.6 ±5.4)g，平均體長(19.5±3.2)cm，隨機分為 6組，每組 3個重復，每個重復30尾魚(雌雄各占1/2)。6組試驗魚分別飼喂在基礎飼料中添加0(對照組)、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg 黃芪多糖(購于陜西方晟生物科技公司，有效含量＞90%)的試驗飼料。

試驗魚以重復為單位飼養于架設在養殖池中的規格為1.5 m ×1.5 m ×1.0 m 的18個網箱中。試驗期間水溫保持在(26±2)℃，每天連續充氧，試驗期間每天換水1/3左右，日投飼率為2%，每日投喂3次，試驗期為8周。

1.2 樣品制備與指標測定

1.2.1 抗凝血及粗酶液的制備

于養殖試驗結束后，每組隨機抽取黃顙魚30尾(雌雄各占1/2)，使用MS－222對試驗魚實行麻醉。擦拭體表后，使用5 m L一次性無菌注射器進行尾靜脈取血，抽血前使用的一次性無菌注射器及離心管預先用1%的肝素鈉進行濕潤。

抽血后的黃顙魚在冰浴條件下進行解剖，剝取心臟、肝胰臟、脾臟、頭腎、中腎、肌肉與鰓組織，各組織再按質量體積比1∶9加入預冷生理鹽水，用YQ－3型電動勻漿機在冰浴條件下進行組織勻漿。用Eppendorf冷凍離心機在4℃，3 000 r/m in離心20 m in，提取上清液即為粗酶液。

1.2.2 抗氧化指標的測定

試驗中各組織超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氫酶(CAT)活力及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及蛋白質含量等指標采用南京建成生物工程技術研究所提供的試劑盒進行測定。

1.2.3 非特異性免疫指標的測定

1.2.3.1 溶菌酶(LSZ)活力的測定

試驗所用溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)由天津科技大學生物工程學院提供。溶壁微球菌接種于瓊脂培養基上，在37℃條件下培養24 h后，用PBS緩沖液稀釋至波長570 nm下吸光度為0.3的菌懸液備用。

表1 基礎飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

取200μL菌懸液與20μL粗酶液在96孔板中混勻，并在酶標儀上使用570 nm的波長測定初始光密度值A0，然后置于27℃下水浴30 m in，取出后立即置于冰浴中終止反應，并在570 nm波長下測定反應后的光密度值A，LSZ活力=(A0－A)/A。

1.2.3.2 吞噬細胞活力的測定

試驗所用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由天津農學院水產生態及養殖重點實驗室提供，使用法國生物梅里埃公司生產的VITEK2－Compact全自動微生物鑒定儀鑒定細菌純度。將細菌接種于瓊脂培養基斜面上，37℃條件下傳代2次，用無菌PBS洗下菌落。離心后加入1%福爾馬林滅活24 h，將菌液調整為1.0×108cell/m L備用。

取100μL抗凝血，加入100μL的金黃色葡萄球菌液，搖勻，在27℃條件下孵育30 m in，孵育期間每隔10 m in搖晃1次。用吸管吸取混合液涂片，用甲醇固定10 m in，Giemsa染色1 h，水洗晾干后鏡檢。吞噬細胞活力分別以吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指數(phagocytic index，PI)表示:

1.2.3.3 疾病抗性檢測

試驗用遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)由天津市病害防治中心提供。于飼喂試驗結束后采用遲鈍愛德華氏菌(2.0×108cell/m L)對各組試驗魚進行攻毒。每組分別取試驗魚20尾(雌雄各占1/2)，經胸鰭基部注射0.2 m L遲鈍愛德華氏菌懸液。飼養觀察96 h后，統計各組的死亡率，依下式計算死亡率(mortality rate，MR)與免疫保護率(protective rate，PR)。

1.3 數據處理

試驗數據用平均值±標準誤表示，數據分析采用 SPSS 17.0軟件包中的單因素方差分析(One-way ANOVA)處理，以P＜0.05作為差異顯著性標準。

2 結果

2.1 黃芪多糖對黃顙魚各組織中SOD活力的影響

黃顙魚體內各組織中SOD活力順序為心臟＞肌肉＞鰓＞肝臟＞頭腎＞中腎＞脾臟(表2)。添加黃芪多糖對心臟、肝臟、脾臟和鰓中SOD活力影響不大(P＞0.05)。與對照組相比，300 mg/kg組頭腎中以及600、900 mg/kg組肌肉中SOD活力分別提高 1.61、1.95與 2.08倍，差異顯著(P＜0.05)。

表2 黃芪多糖對黃顙魚各組織中SOD活力的影響Table 2 Effect of APS on the SOD activity in tissues of yellow catfish U/mg prot

2.2 黃芪多糖對黃顙魚各組織中CAT活力的影響

黃顙魚體內各組織中CAT活性順序為心臟＞肌肉 ＞肝臟 ＞鰓 ＞頭腎 ＞中腎 ＞脾臟(表3)。與對照組相比，600～1 500 mg/kg黃芪多糖能顯著提高黃顙魚心臟、肝臟、脾臟、肌肉與鰓中的CAT活力(P＜0.05)，且各添加組的頭腎與中腎中CAT活力均顯著升高(P＜0.05)。

表3 黃芪多糖對黃顙魚各組織中CAT活力的影響Table 3 Effect of APS on the CAT activity in tissues of yellow catfish U/mg prot

2.3 黃芪多糖對黃顙魚各組織中MDA含量的影響

黃顙魚體內各組織中MDA含量順序為肌肉＜肝臟 ＜鰓 ＜中腎 ＜頭腎 ＜心臟 ＜脾臟(表4)。與對照組相比，300～1 500 mg/kg組肝臟與脾臟中，600～1 500 mg/kg組心臟、頭腎、中腎、肌肉與鰓中的MDA含量顯著降低(P＜0.05)。

表4 黃芪多糖對黃顙魚各組織中MDA含量的影響Table 4 Effect of APS on the MDA content in tissues of yellow catfish nmol/mg prot

2.4 黃芪多糖對黃顙魚各組織中 NO含量的影響

黃顙魚體內各組織中NO含量順序為肌肉＞心臟＞肝臟＞鰓＞頭腎＞中腎＞脾臟(表5)。添加黃芪多糖后，各組織中NO含量均低于對照組，且隨著黃芪多糖水平的增加而降低(除1 500 mg/kg組心臟、頭腎中NO含量略有上升)。其中，各添加組的心臟、肝臟、脾臟與頭腎中以及600～1 500 mg/kg組的頭腎與中腎中NO含量均顯著低于對照組(P＜0.05)。

表5 黃芪多糖對黃顙魚各組織中NO含量的影響Table 5 Effect of APS on the NO content in tissues of yellow catfish nmol/mg prot

2.5 黃芪多糖對黃顙魚體內組織LSZ活力的影響

黃顙魚體內各組織中LSZ活力順序為頭腎＞中腎＞心臟＞脾臟＞鰓＞肌肉＞肝臟(表6)。各添加組各組織中LSZ活力均高于對照組，且在0～1 200 mg/kg范圍內黃芪多糖添加水平與酶活力成正比，所有組織內LSZ活力較對照組均有顯著性的提高(P＜0.05)。

表6 黃芪多糖對黃顙魚各組織中LSZ活力的影響Table 6 Effect of APS on the LSZ activity in tissues of yellow catfish U/mg prot

2.6 黃芪多糖對黃顙魚吞噬細胞活力的影響

投喂含不同水平的黃芪多糖飼料8周后，檢測黃顙魚體內吞噬細胞活力發現，各添加組的吞噬百分比與吞噬指數均顯著高于對照組(P＜0.05)，且隨黃芪多糖添加水平的升高呈增加趨勢，除1 200、1 500 mg/kg組間吞噬百分比無顯著差別外(P＞0.05)，其余各組間的吞噬百分比與吞噬指數隨黃芪多糖水平增加而顯著上升(P＜0.05)(表7)。

表7 黃芪多糖對黃顙魚吞噬細胞活力的影響Table 7 Effect of APS on the phagocytic activity of yellow catfish %

2.7 攻毒試驗結果

黃顙魚養殖8周后，經遲鈍愛德華氏菌活菌攻毒96 h，對照組死亡率為80%，各添加組的死亡率均有所降低，獲得了一定的免疫保護率，尤其是1 200、1 500 mg/kg組，免疫保護率均達到50.0%。此外，試驗中黃顙魚的死亡率與免疫保護率與黃芪多糖添加水平存在一定的劑量關系(表8)。

表8 黃芪多糖對黃顙魚疾病抗性的影響Table 8 Effect of APS on disease resistance of yellow catfish

3 討論

3.1 黃芪多糖對黃顙魚抗氧化指標的影響

NO是近年來研究較多的一種免疫與調控因子，其在生物體內具有雙向調節作用的理論已經被許多研究相繼證實［4－5］;SOD與CAT是生物體抗氧化酶系的重要組成酶類，對生物體內活性氧自由基地清除起著關鍵的作用;MDA則是脂質過氧化物反應中的最終產物，可導致機體細胞的損傷。檢測這些指標可以綜合地判定生物機體的抗氧化與免疫情況。近年來的諸多研究報道均表明，黃芪多糖在促進魚體抗氧化功能提升方面具有明顯的效果。張偉妮等［6］研究發現，在羅非魚(Tilapia)飼料中添加不同劑量的黃芪多糖，可提高魚體SOD與CAT活力，且添加水平在1 000～2 000 mg/kg時提高作用顯著;富麗靜等［7］研究表明，在飼料中添加0.165、0.660 g/kg的黃芪多糖可顯著地提高草魚(Ctenopharyngodon idellus)體內SOD活力;吳旋等［8］試驗得出，使用黃芪多糖浸泡金絲魚(Tanichthrs altbonubes)可以顯著地提高魚體內SOD與CAT活力;劉紅柏等［9］試驗證實，對史氏鱘(Acipenser schrenckiBrandt)灌服不同濃度的黃芪多糖水煎劑，其肝臟與血清中SOD活力較對照組均有所提高，且各濃度組MDA含量顯著降低。這充分說明適宜添加水平黃芪多糖可以有效提高魚體的抗氧化能力。

以上學者的研究結論均可作為本試驗的理論支撐。本試驗的結果顯示，黃芪多糖添加在飼料中投喂黃顙魚，魚體各組織中SOD與CAT活力均提高，且在心臟與鰓等氧交換密切的組織中SOD與CAT活力明顯地高于脾臟、腎臟等組織。同時，與對照組相比，各添加組肝臟與脾臟中MDA含量也得到了顯著地降低。在以前的研究中，鮮有關于魚類肌肉抗氧化酶活力的報道，大多數的研究僅是測定魚體血清、肝臟等少數組織的抗氧化酶活力。而在研究中發現，黃顙魚的肌肉組織抗氧化功能較強，且投喂黃芪多糖后效果更佳顯著。因此，本研究很好的證實了有些魚類的肌肉具有較高的抗氧化功效這一理論，在今后的生產實踐中具有良好地開發前景及應用空間。

關于中草藥多糖對水產動物機體NO的調節機制，科研工作者也進行了相應的研究:黃江［10］通過試驗得到，灌服含黃芪、當歸等成分的復方中草藥水煎液的史氏鱘血液中NO的含量顯著降低，黃芪、魚腥草、甘草復方則可顯著降低史氏鱘肝臟內NO的含量，而單方貫眾、復方四卻對史氏鱘血液中NO含量具有明顯的促進作用;蘇嶺等［11］研究發現，復方甘草與紫草對鯽魚(Carassius aumtus)脾臟內NO含量具有抑制作用，但對肝臟中NO含量卻具有促進作用;同時，黃芪多糖對脾臟中NO的含量也具有促進作用。在本試驗中，黃顙魚肌肉NO含量明顯高于其他組織，但各組織NO含量隨著黃芪多糖添加水平的增加而下降。而此結論卻與有關黃芪多糖在適宜的添加范圍內可促進動物體內NO含量提升的研究結論［6］不盡相同。因此，綜合以上的研究結果得出，黃芪多糖對生物體內NO含量的影響與中草藥、中草藥多糖的種類、劑量、給藥時間、生物機體自身等多種因素有關，在生產實踐中對上述因素應進行仔細考量。

3.2 黃芪多糖對黃顙魚非特異性免疫指標的影響

非特異性免疫能力有LSZ活力、吞噬細胞活性、疾病抗性等多種反應組成，是魚類抵抗病原入侵，維護機體健康的重要特性。近年來，許多學者就黃芪多糖對水產動物非特異性免疫功能的調節作用進行了大量的研究。胡兵等［12］研究發現，添加黃芪多糖能提高異育銀鯽(Carassiusauratus gibelio)體內LSZ活力，且0.05%的添加水平效果最佳;Yin等［13］使用含0.5%黃芪水提物的飼料對鯉魚(Cyprinus carpio)進行投喂，結果發現魚體血液中LSZ活力、吞噬細胞的吞噬活力、疾病抗性與對照組相比均有大幅的提升;孫永新［14］發現，飼料中添加黃芪多糖可有效提高刺參(Apostichopus jaoponicus)體內LSZ活力、吞噬指數與吞噬率，攻毒后試驗組的發病率有所降低;László等［15］用含有黃芪水提物的飼料投喂羅非魚，結果表明魚體LSZ活力顯著高于對照，攻毒后的存活率也有所提高。

以上結論與本試驗得出黃芪多糖可以有效提高黃顙魚體內LSZ活力，且以魚類最主要的免疫器官頭腎中的酶活力最強，對黃顙魚的吞噬細胞活性及疾病抗性的提高也有顯著的功效，并且存在規律的量效關系的結論相一致，進一步證明了黃芪多糖在促進黃顙魚非特異性免疫功能方面的良好效果。

4 結論

①本試驗中，長期連續投喂適宜水平的黃芪多糖能有效地促進黃顙魚體內SOD、CAT活力，降低MDA含量，但對黃顙魚體內NO含量卻具有抑制作用。

②不同添加水平的黃芪多糖對各項抗氧化指標的作用效果存在差異，對 SOD、CAT、MDA及NO指標的最適添加水平分別為600、1 200、1 500和300 mg/kg。

③不同添加水平的黃芪多糖可有效地提高黃顙魚體內LSZ活力、吞噬細胞活性與疾病抗性，且作用功效較為規律，綜合各項指標判定1 200 mg/kg的添加水平對黃顙魚非特異性免疫功能的促進作用最佳。

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*Corresponding author，professor，E-mail:kzxing@yahoo.com.cn

(編輯 菅景穎)

Effect of Astragalus Polysaccharides on Antioxidant and Nonspecific Imm une Indices of Yellow Catfish(Pelteobagrus fulvidraco)over Long-term Feeding

BAIDongqing WU Xuan GUO Yongjun ZHU Guoxia XING Kezhi*NING Bo
(Tianjin Key Laboratory of AQU-ecology and Aquaculture，National Demonstration Center of Teaching Practice，Tianjin Agricultural University，Tianjin300384，China)

This experimentwas conducted to investigate the effect of astragalus polysaccharides(APS)on antioxidant and nonspecific immune indices of yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco).Five hundred and forty 2-year-old and healthy yellow catfish were random ly divided into 6 groups with 3 replicates per group and 30 fish per replicate.Yellow catfish in the 6 groupswere fed basal dietswith 0(control group)，300，600，900，1 200 and 1 500 mg/kg APS，respectively.The experiment lasted for 8 weeks.A t the end of the experiment，the activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)and lysozyme(LSZ)，the contents ofmalondialdehyde(MDA)and nitric oxide(NO)，phagocytic percentage(PP)，phagocytic index(PI)，and disease resistance indiceswere determ ined.The results showed as follows:compared with the control group，the head kidney SOD activity in the 300 mg/kg APS group and themuscle SOD activity in the 600 and 900 mg/kg APS groupswere increased by 1.61(P＜0.05)，1.95(P＜0.05)and 2.08(P＜ 0.05)times，respectively.The CAT activity in heart，liver，spleen，muscle and gill was significantly enhanced when supplemented with 600 to 1 500 mg/kg APS in diets(P＜0.05).The CAT activity in head kidney and mesonephros in all APS groupswas significantly higher than that in the control group(P＜0.05).Compared with the control group，the MDA activity in liver and spleen in the 300 to 1 500 mg/kg APS groups and the MDA activity in heart，head kidney，mesonephros，muscle and gill in the 600 to 1 500 mg/kg APS groupswere significantly increased(P＜0.05)，while the NO content in heart，liver，spleen and head kidney in all groups and the NO content in head kidney and mesonephros in the 600 to 1 500 APS groupswere significantly decreased(P＜0.05).When supplemental levels of APS ranged from 0 to 1 200 mg/kg，the LSZ activity was proportional to APS supplemental level，and the LSZ activity in all tissues was significantly higher than that in the control group(P＜0.05).With increasing APS levels，the PP and PIwere significantly increased(P＜ 0.05).APS could decrease themortality rate and enhance the protective rate when fish were over attacked withEdwardsiella tard，and the protective rate in the 1 200 and 1 500 mg/kg APS groups reached 50.0%，respectively.It is suggested that proper amount of APS supplementation in diets can enhance antioxidant of yellow catfish;additionally，1 200 mg/kg APS supplementation has the greatest effects on enhancing nonspecific immunity function of yellow catfish.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1622-1630］

yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco);astragalus polysaccharides;antioxidant indices;nonspecific immune indices

S963

A

1006-267X(2011)09-1622-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.023

2011－03－23

天津市高等學?？萍及l展基金計劃(2008ZD21和2006ZD24);天津市農業科技成果轉化與推廣項目(201004040)

白東清(1970—)，女，河北遷安人，教授，博士，碩士生導師，主要從事水產動物營養與飼料學的教學和研究工作。E-mail:baidongqing@tjau.edu.cn

*通訊作者:邢克智，教授，碩士生導師，E-mail:kzxing@yahoo.com.cn