HPLC法測(cè)定云南松松針中莽草酸的含量

王 琳 孔艷飛 李愛玲 趙振華 楊梅飛

云南省大理學(xué)院藥學(xué)院，云南 大理 671000

松針 (pine need1e)又名松葉，為松科松屬 (Pinus)植物馬尾松、華山松、黃山松、黑松、油松、云南松、紅松等的針葉，俗稱松毛、山松須、豬鬃松葉等。 《本草綱目》曰:“久服令人不老，輕身益氣，主治風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑延年。”［1］針葉具有活血、祛風(fēng)，燥濕止癢之功，可用于治療風(fēng)濕疥癬等疾病［2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，莽草酸具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛和抑制血小板聚集作用［3－4］，也是目前臨床上唯一對(duì)感染禽流感病毒患者有效藥物“達(dá)菲”的基本原料［5］。目前有關(guān)莽草酸的化學(xué)合成，由于反應(yīng)條件苛刻、成本高而難于滿足市場(chǎng)需求，因此篩選價(jià)廉的莽草酸提取原料顯得十分迫切［6］。我國云南松資源豐富，為了尋找該植物中的活性成分，綜合利用其資源，使其變廢為寶，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定云南松松針中莽草酸的含量，為有針對(duì)性的開發(fā)利用我國各地豐富的云南松資源中莽草酸提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agi1ent 1200型高效液相色譜儀 (包括四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器，chemstation化學(xué)工作站);SY3200－7型超聲波清洗器 (上海聲源超聲儀器設(shè)備有限公司);AE240電子天枰 (梅特勒一托利多儀器 (上海)有限公司)。

莽草酸對(duì)照品 (成都曼斯特生物科技有限公司，HPIC測(cè)定，歸一化法計(jì)算其純度≥99%，批號(hào)A0112)。甲醇為色譜純 (美國Tedia公司)，水為娃哈哈牌純凈水，其它均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

云南松樣品為2010年2月采集于云南省大理市漾濞縣，經(jīng)馬曉匡教授鑒定為云南松 (pinus yunnanensis Franch)。

2 色譜條件

色譜柱為Agi1ent Ec1ipse XDB－C18(4.6mm ×150mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇－1%磷酸水溶液 (3:97)，流速為0.8m1·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為 214nm，柱溫為 25℃。

3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

3.1 理論塔板數(shù) (n) 按莽草酸峰計(jì)算為7766.428，不低于5000。

3.2 分離度 與其它峰的分離度為2.1，均大于1.5;對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣10μ1，記錄色譜圖，莽草酸的保留時(shí)間約為2.8min，見圖1。

4 分析方法認(rèn)證與結(jié)果

4.1 溶液的制備

4.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取莽草酸對(duì)照品0.0078g(7.8mg)，置于100m1容量瓶中，加重蒸水溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液 (每1m1含莽草酸78ug)。

4.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取云南松松針0.1003g，置于100m1具塞錐形瓶中，加重蒸水60m1，超聲處理 (功率200W，頻率33kHz)90min，過濾，定容至100m1，臨用前用0.45μm微孔濾膜過濾并裝入進(jìn)樣瓶中，得云南松松針供試品溶液。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取莽草酸對(duì)照品貯備液1，2，4，6，8，10，12，14m1，分別置于25m1容量瓶中并定容，濃度 分 別 為 3.12 ug/m1，6.24 ug/m1，12.48 ug/m1，18.72 ug/m1，24.96 ug/m1，31.20 ug/m1，37.44 ug/m1，43.68ug/m1，搖勻，用0.45um微孔濾膜過濾并分別裝入進(jìn)樣瓶中備用。分別精密吸取10u1注入色譜儀，得進(jìn)樣量C(ug)與峰面積A的線性方程。結(jié)果表明，莽草酸進(jìn)樣量在0.0312～0.4368ug與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為 A=5042.6C+28.2490，r=0.9999(n=8)。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精取莽草酸對(duì)照品溶液 (31.20ug/m1)10u1，重復(fù)進(jìn)樣 5次，測(cè)得色譜峰峰面積平均值為1602.0859，RSD為0.037%，符合分析要求。

4.4 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批云南松松針干燥粉末6份，按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得莽草酸含量的平均值為1.34%，RSD為3.04%，符合分析要求。

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取云南松松針供試品溶液，在“2”項(xiàng)色譜條件下，于0、4、8h分別測(cè)定莽草酸峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為0.54%，表明供試液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.6 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) (加樣回收試驗(yàn)) 精密稱取已知含量的云南松松針粉末約0.1g，共6份，分別精密加入一定量的莽草酸對(duì)照品，按供試品溶液制備及測(cè)定法操作，分別進(jìn)行色譜分析，其平均回收率為99.97%，RSD為1.06%，符合分析要求。結(jié)果見表1

表1 莽草酸加樣回收率(n=6)

5 討論

5.1 測(cè)定方法的選擇 目前，國內(nèi)外對(duì)莽草酸的測(cè)定有正相色譜法、離子抑制反相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。雖然這些方法可以測(cè)定莽草酸，但是存在不足之處:使用正相色譜時(shí)，不但要用專用正相色譜柱而且流動(dòng)相大部分是乙腈，運(yùn)行成本較高;離子抑制反相色譜法使用PH值很低的酸水，對(duì)普通ODS柱長(zhǎng)期使用會(huì)損壞填料;毛細(xì)管電泳法是一種較新的檢測(cè)方法，但其重現(xiàn)性較差。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定莽草酸含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合莽草酸含量測(cè)定要求，且運(yùn)行成本低。

5.2 供試品溶液的制備方法的選擇 試驗(yàn)中分別考察了超聲提取、加熱回流、索氏提取等方法的提取效果，以超聲提取法最為省時(shí)，提取效率最高。而超聲提取法中，又分別比較了不同的溶劑 (重蒸水、甲醇、95%乙醇)、不同超聲時(shí)間、溶劑不同體積倍數(shù)的提取效果，試驗(yàn)表明以60倍量的重蒸水為提取溶劑，超聲90min，可將莽草酸基本提取完全［7］。

5.3 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)比較了甲醇－水、乙腈－水等流動(dòng)相系統(tǒng)［8，9］，從分離情況和出峰時(shí)間等綜合分析選擇甲醇－1%磷酸水溶液等度洗脫為佳，且保留值適宜，柱后處理簡(jiǎn)便、省時(shí)。

5.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用二極管陣列檢測(cè)器在本試驗(yàn)溶劑體系條件下，分析了莽草酸對(duì)照品色譜峰和樣品中目標(biāo)組分相應(yīng)色譜峰的紫外光譜，結(jié)果保留值相同處紫外光譜基本一致，莽草酸在214nm處有最大吸收。待測(cè)組分與雜質(zhì)峰基本能基線分離，檢測(cè)靈敏度高，確定莽草酸檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。

目前，莽草酸主要來源于八角屬植物八角茴香等果實(shí)中，但資源十分有限，無法滿足市場(chǎng)的需求［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明云南松松針中莽草酸含量較高，且云南松松針是云南松的主要副產(chǎn)物，再生速度快，且可持續(xù)利用。云南松松針的試驗(yàn)方法及試驗(yàn)結(jié)果有對(duì)莽草酸含量的研究提供了依據(jù)，也表明了云南松松針中莽草酸的開發(fā)將有巨大的潛力。

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