中藥獨活中總香豆素高通量分析方法的建立

李 晉 郭新榮 張秋紅 常艷旭

天津市現代中藥重點實驗室天津中醫藥大學，天津 300193

獨活為傘形科植物重齒毛當歸［Ange1ica pubescens Maxim f biserrata Shan et Yuan］的根，是一種常見的中藥，具有祛風除濕，通痹止痛之功效，用于風寒濕痹，腰膝疼痛，少陰伏風頭痛，風寒協濕頭痛［1］?，F代研究表明，獨活含有數十種香豆素類化合物，如東莨菪內脂、傘形花內脂、二氫山芹醇、補骨脂素、二氫歐山芹醇乙酸酯，蛇床子素、異歐前胡素二氫歐山芹素等，其中蛇床子素含量最高［1］。

目前，獨活總香豆素含量測定方法主要以采用紫外分光光度法為主［2－3］，但該種方法由于每次僅能1－3個樣品，具有低通量的特點，不適合大量的樣品檢測。因此，本試驗以蛇床子素為對照品，用多功能讀板機，擬建立一種高通量的獨活中總香豆素含量測定方法，為獨活藥材及飲片控制提供一種簡單、快速、高通量的分析方法。

1 儀器與試藥

AX－105十萬分之一天平;BP121S萬分之一天平 (德國賽多利斯);SB－1000YDTD超聲清洗槽 (寧波新芝科技股份有限公司，40KHZ);微量多功能讀板機 (infinite M200);96孔板 (Cos96ft－Corning 96 F1at Transparent)。

蛇床子素對照品 (成都曼斯特生物科技有限公司)，甲醇 (色譜純)，無水乙醇 (分析純)，純水，不同產地獨活飲片購買于藥材各地藥材市場，經作者鑒定為傘形科獨活。分別粉碎，過100目篩，密封保存，備用。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取減壓干燥至恒重的蛇床子素對照品2 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成400 μg/mL的蛇床子素標準液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取獨活藥材粉末0.125 g，置10 mL具塞試管中，加60%甲醇定容至10 mL，超聲40 min，稱定重量，聲提取40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3 結果

3.1 測定波長的選擇

分別精確量取對照品溶液及供試品溶液各0.2 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，在波長為200～400 nm范圍內掃描，對照品溶液和供試品溶液均在315～325 nm范圍內有明顯吸收，吸收峰在320 nm附近，故選擇320 nm作為測定波長。

3.2 方法學驗證

3.2.1 標準曲線

精密吸取一定量蛇床子素標準液置10m1容量瓶中，加入甲醇稀釋得到3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 μg/m1溶液。以甲醇為空白對照，繪制標準曲線:y=0.0331x－0.0089(r=0.9995)。結果表明蛇床子素質量濃度在3～60ug/m1范圍內，呈良好的線性。

3.2.2 精密度

精密吸取8μg/m1對照品溶液200 μ1，加入到96孔板中，320nm波長下測定吸光度，重復測6次，吸光度值RSD 為0.27%。

3.2.3 重復性

取同一批藥材6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，測定總香豆素的含量為2.17%，RSD為1.83%，表明該方法重復性好。

3.2.4 穩定性試驗

取供試品溶液0.2 mL，按標準曲線制作方法，分別在1，2，6，8，12，16，24 h測定吸光度，考察樣品24 h穩定性。經計算，RSD=0.87%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

3.2.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的獨活樣品粉末約0.05g，共6份，置10 mL具塞試管中，分別加入質量為1086 μg的標準品，按供試品溶液制備方法，制備含對照品的樣本溶液6份，測定并計算，結果見表1，平均回收率為98.9%，RSD為 3.00%。

表1 加樣回收實驗結果

3.3 樣品測定

精密稱取不同來源獨活飲片粉末，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液0.2 mL，按標準曲線制作方法測定其吸光度。利用回歸方程求出供試品溶液中折合蛇床子素的濃度 (總香豆素)，并計算獨活中總香豆素的含量，結果見表2。

4 討論

本研究以蛇床子素為對照品，利用多功能讀板機，建立了可同時測定96個獨活樣品中總香豆素高通量含量測定分析方法，并對不同產地的獨活飲片進行了總香豆素的含量測定，結果表明該方法簡便、準確，適用于中藥獨活藥材中總香豆素含量測定。同時發現不同地區即使相同產地的獨活飲片質量存在很大差異;不同批次的獨活樣品中總香豆素的質量分數在0.95～3.39%，均值2.69%。該研究結果表明了所建的高通量的分析方法簡單，穩定可靠，重復性好，可用于獨活的質量控制，為獨活質量標準的制定提供參考。

表2 不同產地獨活總香豆素含量

［1］中國藥典 (一部)［S］.2010年版，2010:246－247.

［2］常艷旭，朱子微，李晉，張秋紅，秦緒.高效液相色譜法同時測定獨活中七種有效成分含量及在質量評價中應用［J］.內蒙古大學學報 (自然科學版)，2011，42(2):121－129.

［3］張恭孝，李聚倉，王德才.獨活中總香豆素組分的含量測定［J］.中華中醫藥學刊，2010，28(12):2647－2648.

［4］但飛君，蔡正軍，郭軍輝，潘家榮，王力.中藥白根獨活中總香豆素成分的含量測定［J］.三峽大學學報 (自然科學版)，2008，30(6):91－93.