丹參溢心膠囊微生物檢查法驗證

田昭翠 韋繼雯

云南省文山州食品藥品檢驗所，云南 文山 663000

為探討丹參溢心膠囊微生物限度，我們對該藥品的微生物限度檢查進行了細菌，霉菌和酵母菌計數(shù)方法及控制菌檢查方法驗證。

1 試驗材料

1.1 試藥與培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉、改良馬丁培養(yǎng)基PH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液 (均來源于中國生物制品檢定所)氯化鈉分析 (汕頭市西隴化工有限公司)。

1.2 樣品

丹參溢心膠囊，批號為2010021，20100418，20100719由云南文山特安吶制藥有限公司生產(chǎn)，編號為1，2，3。

1.3 儀器

電熱鼓風干燥箱 (型號:DG101—1A，北京市永光醫(yī)療儀器廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (型號:PYX—34×40，上海市躍進醫(yī)療器械七廠);電子恒溫水浴鍋 (DZKW—4，上海科析試驗儀器廠);電熱手提式壓力蒸汽消毒器 (型號:YXQ1280，上海醫(yī)療用核子儀器廠);電子恒溫水浴鍋 (DZKW—4，上海科析試驗儀器廠)。

1.4 陽性對照菌

枯草芽胞桿菌 ［CMCC(B)63501］，大腸埃希菌［CMCC(B)44102］，金黃色葡萄球菌 ［CMCC(B)26003］，白色念珠菌 ［CMCC(F)98001］黑曲霉 ［CMCC(F)980003］。均由云南省食品藥品檢驗所提供。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

分別取供試品10g，加入PH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100m1，45℃水浴15分鐘混勻，制成1∶10的供試液，取2m1加入8m1PH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液混勻，制成1:50的供試液，取1m1加入9m1PH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液混勻，制成1∶100的供試液，備用。

2.2 菌液的制備

①取經(jīng)36±1℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌，枯草芽胞桿菌，金黃色葡萄球菌的肉湯培養(yǎng)物1m1，用0.9%氯化鈉溶液稀釋到10－5－10－7。②取經(jīng)26±1℃培養(yǎng)18－24h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1m1，用0.9%氯化鈉溶液稀釋到10－6。③接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23－28℃培養(yǎng)5－7天，加入3m1 0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出1m1，用0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋到10－51m1。以上三種使成每1m1含50—100cfu，經(jīng)活菌計數(shù)備用。

2.3 回收率測定

2.3.1 直接接種法 每組平行試驗2份①試驗組取供試液1m1，加入各菌液1m1，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基;②菌液組取上述菌液1m1注入平皿后，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基;③供試品對照組取供試品1m1，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基;④取稀釋液1m1注入平皿，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基，作陰性對照。大腸埃希菌，枯草芽胞桿菌，金黃色葡萄球菌的平皿注入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h，白色念珠菌和黑曲霉的平皿注入玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，置25－27℃培養(yǎng)72h。結(jié)果見表1。

表1 直接接種法(取平均值個/m1)

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 平行試驗2份。①試驗組取1:10，1:50、1:100供試液1m1，分別注入5個平皿中，每皿0.2m1，加入枯草芽胞桿菌菌液1m1，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基;②菌液組取菌液枯草芽胞桿菌1m1注入平皿后，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基;③供試品對照組取供試品1m1，分別注入5個平皿中，每皿0.2m1，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基;培養(yǎng)。結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法枯草芽胞桿 (取平均值個/m1)

2.4 回收率的計算方法

2.5 控制菌檢查法驗證

本品為口服制劑，按2005年藥典標準檢查控制菌是大腸埃希菌，平行試驗2份。①供試液對照組:取1:10供試液10m1接種于100m1的膽鹽乳糖增菌液;②試驗組:按方法①再加入1m1相應的陽性對照菌，混勻;③陰性對照組:按①取樣后，膽鹽乳糖增菌液中加1m1金黃色葡萄球菌;④陽性對照組:取1m1大腸埃希菌加入100m1膽鹽乳糖增菌液中。于36±1℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物0.2m1，加入含5m1MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，用MUG培養(yǎng)基作對照，分別于5h和24h在360nm紫外線下觀察，。沿管辟加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，觀察。試驗結(jié)果:供試品對照組未檢出大腸埃希菌，陽性對照組檢出相應的陽性菌。陰性對照組未檢出大腸埃希菌，結(jié)果表明可用常規(guī)法進行檢查。

3 討論

丹參溢心膠囊是由三七、紫丹參、燈盞細辛等組成，主要用于活血化瘀，具有一定的抑菌作用。從表1、2可見，樣品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率大于70﹪。證明其對上述4種菌無抑菌作用。枯草芽胞桿菌有抑菌作用，在1:10稀釋級回收率均不過20﹪，1:50、1:100稀釋級回收率均大于70﹪，故1:10稀釋級應采用培養(yǎng)基稀釋法測定該樣品的微生物限度，在1:50、1:100稀釋級可用常規(guī)方法測定。

根據(jù)上述結(jié)果，丹參溢心膠囊在生產(chǎn)工藝，組成成份及原檢驗條件不變時，微生物限度檢查細菌數(shù)測定用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌和酵母菌數(shù)測定用直接法，控制菌用常規(guī)法測定。

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