食用白酒對實驗性肝纖維化TGF-β1的影響

劉春光 （公安縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 公安434300）

盧 平 （長江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊州434020）

肝纖維化是各種慢性肝損傷共有的組織變化，和肝硬化是連續(xù)的發(fā)展過程，為可逆性病變，其中心環(huán)節(jié)是肝星狀細胞 （HSC）激活并轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞樣細胞 （MFB）、細胞外基質(zhì) （ECM）過度合成和基質(zhì)降解能力下降。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）為現(xiàn)知最強力的肝纖維化促進因子，是激活HSC并促進其表達ECM的關(guān)鍵因子。國內(nèi)有學(xué)者報道了貴州茅臺酒能延緩肝纖維化的發(fā)展［1］，引起了關(guān)注。我們通過觀察茅臺酒對實驗性肝纖維化TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，來探討茅臺酒對肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 雄性 Wistar大鼠79只，體質(zhì)量230～270g，常規(guī)條件下飼養(yǎng) ，溫度 （22±2）℃，濕度 （55±5）%，人工照明1h，自由取水取食，飼料由公司提供，飲用水為自來水飼養(yǎng)。

1．1．2 試劑 53% （V／V）貴州茅臺酒 （批號：6845169830，驗證碼：5212635463568104），無水乙醇 （分析醇），四氯化碳 （CCL4）分析純，蓖麻油分析純，0．9%氯化鈉溶液。

1．2 方法

1．2．1 動物模型的制備 按照隨機數(shù)字表隨機分成6組。①正常對照組 （n＝9）：0．9%氯化鈉溶液灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；②茅臺酒 CCL4組 （n＝12）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射（0．2ml／100g，2次／周，首劑加倍。下同），同時給予53% （V／V）貴州茅臺酒灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；③乙醇CCL4組 （n＝13）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射同時，給予53% （V／V）乙醇灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；④茅臺酒組 （n＝14）：53% （V／V）貴州茅臺酒灌胃；⑤乙醇組 （n＝16）：53% （V／V）乙醇灌胃；⑥CCL4造模組 （n＝15）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射，同時生理鹽水灌胃。

1．2．2 觀測指標及方法 實驗第2周，CCL4造模組、乙醇CCL4組分別死亡1只。實驗第4周和第8周末分批處死動物40、37只，取血和肝臟。血清標本在-20℃保存待測，同時取肝臟組織，記大體情況，取部分肝臟固定于4%多聚甲醛內(nèi)，常規(guī)石蠟包埋，2μm連續(xù)切片。①血清肝功能檢測：采用全自動生化儀測定ALT、AST、ALB血清濃度的改變；②血清肝纖維化檢測：放射免疫法檢測層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原 （PCⅢ）血清濃度的改變；③免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β1：采用SABC法，用DAB顯色，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作；一抗?jié)舛染鶠?∶150，陰性對照用PBS代替一抗。結(jié)果判定：陽性染色者在細胞漿或／和細胞膜呈棕色顆粒沉著。隨機取5個高倍視野計數(shù)陽性細胞，小于5% （-），6%～25% （＋），26%～50% （＋＋），51%以上為 （＋＋＋）。④病理形態(tài)學(xué)觀察：HE染色，由同一病理專科醫(yī)師光鏡下做肝纖維化病理學(xué)分級［2］：0級，無纖維化；Ⅰ級，匯管區(qū)擴大，纖維化；Ⅱ級，匯管區(qū)周圍纖維化或纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；Ⅲ級，纖維間隔大量形成伴小葉結(jié)構(gòu)混亂，無肝硬化；Ⅳ級，肝硬化。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果以±s表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件包（11．5版）進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用t檢驗；計數(shù)資料采用秩和檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠血清肝功能變化

同正常對照組相比，各造模組ALT、AST水平明顯升高 （P＜0．05），茅臺酒組和乙醇組ALB有一個先升高后降低的過程，茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組ALB水平持續(xù)降低。同正常對照組相比，茅臺酒組的ALT、AST在第4周末無統(tǒng)計學(xué)差異性 （P＞0．05），兩組ALB差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），到第8周末時ALT有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），ALB差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）；乙醇組ALT、AST在第4周末、第8周末有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），ALB差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。同CCL4組相比，乙醇CCL4組在第4周末、第8周末對肝功能的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），在第8周末茅臺酒CCL4組ALB有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05）。在第4周末，茅臺酒和乙醇組比較，ALT、ALB有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），AST差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），到第8周末，ALT仍有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），ALB差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。在第4周末、第8周末茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組肝臟功能差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組ALT、AST差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），ALB有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05）。見表1。

2．2 對血清LN、PCⅢ的影響

各個造模組的LN、PCⅢ均升高，茅臺酒組升高不明顯，其他各組明顯升高 （P＜0．05）。在第4周末，茅臺酒組和乙醇組、乙醇CCL4組和茅臺酒CCL4組的LN之間有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），但是PCⅢ差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。在第4周末，同CCL4組比較，乙醇組PCⅢ有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），LN則差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），乙醇CCL4組LN、PCⅢ無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。在第8周末，同CCL4組相比，乙醇組、茅臺酒CCL4組PCⅢ有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），LN無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），茅臺酒組LN、PCⅢ有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05）。在第4周末、第8周末，同對照組比較，乙醇組、茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組LN、PCⅢ有有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），茅臺酒組LN、PCⅢ無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組LN、PCⅢ無差異性。見表2。

在第4周末、第8周末，同組大鼠血清肝功能和纖維化指標的比較見表3。

2．3 各組大鼠肝纖維化病理學(xué)表現(xiàn)

正常對照組肝小葉內(nèi)網(wǎng)狀纖維支架完整，分布規(guī)則，無膠原纖維存在。四氯化碳造模組、茅臺酒四氯化碳組、乙醇四氯化碳組第4周末出現(xiàn)纖維間隔，肝臟細胞大量空泡變性，脂肪變性，部分小葉結(jié)構(gòu)混亂。到第8周末，大量老鼠肝臟組織內(nèi)假小葉形成，部分出現(xiàn)肝臟硬化。茅臺酒組只有部分出現(xiàn)肝纖維化，罕見纖維間隔。在第4周末、第8周末：同對照組相比，茅臺酒對纖維化的病理學(xué)分級無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），乙醇組則有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05）；同CCL4組相比，茅臺酒組、乙醇組有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0．05），茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0．05）；茅臺酒組和乙醇組之間病理學(xué)分級有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0．05），茅臺酒CCL4組和乙醇CCL4組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組病理學(xué)分級無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），乙醇組、茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0．05）。見表4。

表1 各組Wistar大鼠血清肝功能結(jié)果

表2 各組大鼠血清LN、PCⅢ的變化

表3 各組Wistar大鼠血清肝功能和纖維化指標在第4周末、第8周末的比較

表4 各組Wistar大鼠肝纖維化病理學(xué)分級 例

2．4 對TGF-β1 表達的影響

TGF-β1在正常肝臟門靜脈周圍細胞及小葉中央靜脈周圍細胞和匯管區(qū)的結(jié)締組織偶見表達，著色較淡。隨著肝纖維化程度的逐步加重，其陽性表達越來越明顯，在匯管區(qū)周圍非實質(zhì)細胞、竇壁細胞、纖維間隔、竇周細胞、中央靜脈周圍細胞及部分肝臟細胞均見陽性表達。在第4周末、第8周末，茅臺酒組和乙醇組之間TGF-β1陽性表達有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0．05）。茅臺酒CCL4組和乙醇CCL4組之間無統(tǒng)計學(xué)差異P＞0．05）。同對照組相比，乙醇組TGF-β1陽性表達有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0．05），茅臺酒組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）。同CCL4組相比，茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組TGF-β1陽性表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅臺酒組TGF-β1陽性表達無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），乙醇組、茅臺酒CCL4組、乙醇CCL4組、CCL4組TGF-β1陽性表達有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0．05）。見表5。

表5 各組大鼠TGF-β1表達的變化 例

3 討 論

肝纖維化是各種慢性肝損傷共有的組織變化，病理特點為匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)ECM過度沉積。其中心環(huán)節(jié)是HSC激活并轉(zhuǎn)化成MFB、ECM過度合成和基質(zhì)降解能力下降。TGF-β1能促進HSC合成膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細胞外基質(zhì)，并抑制間質(zhì)金屬蛋白酶 （MMPs）合成，促進HSC分泌金屬蛋白酶組織抑制物 （TIMPs）等而減少ECM的降解［3］。

現(xiàn)有研究證明阻斷TGF-β1信號通路可明顯阻斷肝纖維化進展［4］。TGF-β1信號分子通過跨膜的受體復(fù)合物進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實驗研究表明，茅臺酒對LN、PC的影響不明顯，乙醇卻有明顯的影響。同CCL4組相比，茅臺酒CCL4組在第8周末對ALB、PCⅢ的影響顯示出統(tǒng)計學(xué)差異，乙醇CCL4組無統(tǒng)計學(xué)變化，提示同乙醇相比，茅臺酒可以延緩四氯化碳造成的纖維化損傷。

在本研究中，茅臺酒組對TGF-β1表達的影響和乙醇組間有統(tǒng)計學(xué)差異。TGF-β1是激活HSC的關(guān)鍵因子。在茅臺酒的影響下，其陽性表達降低，會對肝纖維化的發(fā)展有一定的抑制作用。

茅臺酒是知名國酒，其含有一定量蛋白質(zhì)，18種氨基酸，多種維生素和微量元素，富含超氧化物歧化酶，甲醇、苯和醛類化合物的含量遠低于國際標準。并有初步的研究表明茅臺酒可以誘導(dǎo)肝臟金屬硫蛋白含量增加［1］。在我們的研究中，茅臺酒組對肝臟有一定的損傷，但茅臺酒沒有顯著增加TGF-β1的表達，可通過影響TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對肝纖維化有一定的抑制作用。

［1］程明亮，吳君，張文勝，等 ．茅臺酒對肝臟的作用及其影響的實驗研究 ［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83（2）：237-241．

［2］Hayasaka A，Saisho H．Serum markers as tools to monitor liver fibrosis ［J］ ．Digestion，1998，59：381-384．

［3］Gressner A M．Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis ［J］．Front Biosci，2002，7：793-807．

［4］汪玲，胡國齡，譚德明 ．TGF-β1Ⅱ型受體部分基因表達質(zhì)粒對實驗性大鼠肝纖維化的影響 ［J］．中華傳染病雜志，2002，20（3）：168-171．