結(jié)核病的分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

路 超，劉義慶，王長印，盧志明

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021)

近10余年來，結(jié)核病發(fā)病呈全球持續(xù)惡化，2007年死于結(jié)核病的患者約177萬［1］。結(jié)核桿菌是結(jié)核病的主要致病菌，可在人群中傳播，對(duì)外界環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，易產(chǎn)生耐藥菌株。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查簡便易行，但特異性、靈敏度較差，血清學(xué)等敏感性或特異性不理想。分子生物學(xué)診斷技術(shù)是一種簡便、快速、靈敏、特異、試劑穩(wěn)定、無危害性的結(jié)核病診斷和分類鑒定方法，現(xiàn)對(duì)其研究進(jìn)展綜述如下。

1 結(jié)核桿菌的分子生物學(xué)特點(diǎn)

1998年英國Sanger中心和法國的Pasteur研究所合作開展了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的全基因組測(cè)序工作［2］，證實(shí)結(jié)核桿菌全基因組由4 411 529 bp組成，富含許多重復(fù)序列，尤其是插入序列，亦包括新的基因家族和管家基因。GC堿基含量高達(dá)65.6%，有約3 924個(gè)開放閱讀框，其中約40%有功能，44%可能有功能，16%稱為孤獨(dú)序列。間隔子是斷裂基因中所具有的非編碼序列，結(jié)核分枝桿菌的順向重復(fù)序列被非重復(fù)的獨(dú)特間隔子(長度34～41 bp)分隔。主要的多態(tài)串聯(lián)重復(fù)是結(jié)核分枝桿菌染色體中一種主要類型的重復(fù)DNA，由10 bp的短串聯(lián)重復(fù)序列被5 bp的間隔子分隔組成。重組質(zhì)粒PTBN12包含有一個(gè)3.4 kb的插入序列。2001年Fleischmann等［3］對(duì)結(jié)核桿菌CDC1551全基因組進(jìn)行測(cè)序工作，并與H37Rv株的序列進(jìn)行比較，得出基因多樣性在結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色的結(jié)論。

2 結(jié)核病的分子生物學(xué)診斷技術(shù)

2.1 核酸擴(kuò)增技術(shù) PCR技術(shù)及其他體外核酸擴(kuò)增技術(shù)在結(jié)核病領(lǐng)域的應(yīng)用，為結(jié)核病的診斷和鑒別診斷開辟了新途徑。

2.1.1 單純PCR技術(shù) ①經(jīng)典的PCR技術(shù)。選用一對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測(cè)擴(kuò)增后的目的片段來鑒別細(xì)菌。此方法一般僅能將細(xì)菌鑒別到屬或群，對(duì)種的鑒別意義不大。Elbir等［4］報(bào)道了一種簡單、快速、敏感的菌落PCR技術(shù)，不需抽提結(jié)核分枝桿菌的DNA，直接在反應(yīng)混合物中加入乙醇，可于2 h內(nèi)有效殺死結(jié)核分枝桿菌，其認(rèn)為該法可簡化診斷步驟，降低操作者潛在感染幾率。②非經(jīng)典的PCR技術(shù)。包括逆轉(zhuǎn)錄PCR及巢式PCR、半巢式PCR。逆轉(zhuǎn)錄PCR時(shí)一個(gè)細(xì)胞中rRNA數(shù)量是DNA的100倍，因此擴(kuò)增產(chǎn)物增多，試驗(yàn)的靈敏度大大提高。該法可用于結(jié)核病的診斷，缺點(diǎn)是無法區(qū)別死菌和活菌。巢式PCR、半巢式PCR采用內(nèi)外兩對(duì)引物，進(jìn)行兩次擴(kuò)增，內(nèi)引物以外引物擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增。可提高檢測(cè)的靈敏度，亦可從臨床標(biāo)本中直接檢出結(jié)核分枝桿菌，能用于種屬鑒別。單管平衡半巢式PCR可有效控制污染，提高擴(kuò)增效率;單管巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR可區(qū)分死菌與活菌。

2.1.2 在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的核酸擴(kuò)增技術(shù) ①PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)。是檢測(cè)單堿基突變可靠而簡便的方法。PCR產(chǎn)物為兩條互補(bǔ)單鏈，各單鏈的堿基序列不同可形成不同的空間構(gòu)象，在凝膠上顯示不同的帶型，可確定有無突變。目前采用PCR-SSCP技術(shù)分析耐多藥結(jié)核桿菌的耐藥機(jī)理已成為研究熱點(diǎn)，尤其是該法直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌耐藥基因的成功，將會(huì)對(duì)傳統(tǒng)結(jié)核藥敏試驗(yàn)產(chǎn)生新的挑戰(zhàn)。Sheen等［5］學(xué)者檢測(cè)比嗪酰胺的耐藥基因，與其他四種技術(shù)相比，PCR-SSCP技術(shù)快速、高效、價(jià)格低廉，對(duì)指導(dǎo)臨床治療及用藥有一定應(yīng)用價(jià)值。另有學(xué)者用PCRSSCP技術(shù)檢測(cè)了22株耐多藥的結(jié)核藥菌株katG、rpoB、rpsl基因突變，分別檢出突變基因16株、19株、14株，但該法不能確定突變部位和性質(zhì)，對(duì)操作技術(shù)要求過高，影響因素較多，目前只在條件較好的實(shí)驗(yàn)室開展研究。②序列特異引物—多聚酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)。PCR-SSP的引物是根據(jù)不同類型核心序列關(guān)鍵幾處堿基的差異而設(shè)計(jì)，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，呈現(xiàn)為不同的階梯狀擴(kuò)增片段圖譜。墨西哥學(xué)者M(jìn)éndez等［6］首次用PCR-SSP技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病患者KIR基因多態(tài)性，簡單、快速。③PCR與核酸探針技術(shù)的結(jié)合。當(dāng)靶基因存在時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量呈正比，可定量測(cè)定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特性，可提高目的基因檢測(cè)的特異性。Pinsky等［7］用了一種穩(wěn)定、快速、兩步多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，在60個(gè)臨床樣品中，檢測(cè)到3例為卡介苗，57例為結(jié)核分枝桿菌，可用于常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室。另有學(xué)者介紹了一種寬范圍定量的巢氏Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法，具有較高的準(zhǔn)確性和較廣的檢測(cè)范圍。另外，分子燈塔技術(shù)亦適合于檢測(cè)點(diǎn)突變。Gomez等［8］為了增加其臨床應(yīng)用價(jià)值，建立了一個(gè)客觀的檢測(cè)rpoB突變的分子信標(biāo)qPCR方法，敏感度和特異性均提高。④限制性片段長度多態(tài)性及限制性內(nèi)切酶分析。是以PCR為基礎(chǔ)的分類鑒定技術(shù)和限制性內(nèi)切酶分析相結(jié)合的技術(shù)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，不同分枝桿菌電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性。Caws等檢測(cè)了耐異煙肼的KatG-315突變基因，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，其敏感性提高到80%，而特異性可達(dá)100%。有研究通過對(duì)65 kD蛋白基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切分析，準(zhǔn)確檢測(cè)出結(jié)核桿菌的屬內(nèi)歸屬。限制性片段長度多態(tài)性及限制性內(nèi)切酶分析法是鑒定分枝桿菌種的可靠程序，較形態(tài)學(xué)和生理、生化特征等常規(guī)方法更準(zhǔn)確、快速。⑤PCR-基因缺失分析。分析結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組序列后發(fā)現(xiàn)，有16個(gè)區(qū)域(RD1-RD16)在結(jié)核分枝桿菌成員中缺失存在差異。因此，應(yīng)用PCR技術(shù)探查基因組特異的區(qū)域是否存在，通過特定的缺失圖譜可區(qū)別各成員。Pounder等［9］應(yīng)用PCR基因缺失—解鏈溫度分析結(jié)核分枝桿菌的不同成員，準(zhǔn)確率為94%。該方法最突出的優(yōu)點(diǎn)是可簡單快速地鑒別MTC成員。⑥隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA。原理是用一條人工合成寡核苷酸引物對(duì)整個(gè)DNA鏈進(jìn)行探查，在較低溫度下與匹配或部分匹配的退火位點(diǎn)結(jié)合，擴(kuò)增出呈現(xiàn)多態(tài)的DNA片段，經(jīng)電泳后可得到DNA指紋圖譜，從而進(jìn)行菌種鑒定。Esteban等檢測(cè)鑒定了戈登分支桿菌，此方法對(duì)標(biāo)本要求不高，簡單快速，成本較低，且又無需預(yù)知靶DNA序列。⑦逆轉(zhuǎn)錄—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增—酶聯(lián)免疫法(RT-LAMP-ELISA-hybridization)。由 Lee 等［10］發(fā)明的一種新技術(shù)，用于快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA，檢測(cè)靈敏度為94.1%，高效、低價(jià)，有望用于常規(guī)臨床檢測(cè)。⑧異源雙鏈分析。是將含有突變基因和同段無突變基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，加熱變性后再復(fù)性，若待測(cè)基因有突變，則在復(fù)性過程中可形成部分來源于突變與無突變基因的異源雙鏈，同時(shí)亦形成部分同源雙鏈。根據(jù)電泳遷移率的差別判斷有無基因突變。

2.2 DNA探針技術(shù) 核酸探針是指用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記已知DNA或RNA片段，檢測(cè)樣品中未知的核苷酸序列，經(jīng)顯影、顯色或熒光檢測(cè)的方法，將結(jié)合核苷酸的位置或大小顯示出來。迄今為止，用于結(jié)核桿菌快速檢測(cè)和鑒定的探針有cDNA探針、全染色體核酸探針、寡核苷酸探針、克隆核酸探針和DNA片段探針等，檢測(cè)方法有膜斑點(diǎn)雜交、原位雜交、印跡雜交和液相雜交等。核酸探針技術(shù)的顯著特點(diǎn)是高度特異性，可用于結(jié)核病的診斷、菌種鑒定和耐藥性檢測(cè)等方面，使用最廣泛的是反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)及反向線點(diǎn)雜交技術(shù)。有學(xué)者鑒定了15種臨床上常見的分枝桿菌，與傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)和測(cè)序相比敏感性和特異性均為100%。基因芯片基于反向雜交技術(shù)，將大量靶基因探針高密度排列固定于一塊特殊處理的載體上，標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與載體上的探針進(jìn)行雜交，以特定儀器檢測(cè)雜交信號(hào)而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。Sanguinetti等［11］用此技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，需樣本少、準(zhǔn)確、信噪比極小且易于操作，開辟了新的臨床診斷視野。由于芯片制備較復(fù)雜，檢測(cè)成本高，臨床實(shí)驗(yàn)室很難推廣使用。WHO推出了一種線性探針檢測(cè)法，由德國一家企業(yè)開發(fā)，可直接用患者的唾液來判斷其中的結(jié)核菌是否對(duì)兩種常用藥物具有抗藥性，便于醫(yī)生快速做出診斷。

2.3 指紋圖譜技術(shù) 在結(jié)核分枝桿菌染色體DNA中選擇合適的重復(fù)序列作為遺傳標(biāo)志，建立DNA指紋圖譜技術(shù)，可檢測(cè)出流行病學(xué)上無關(guān)菌株的DNA多態(tài)性。用限制性內(nèi)切酶消化結(jié)核分枝桿菌染色體DNA上特定的核苷酸序列，電泳分離后，將片段轉(zhuǎn)移至膜上，與帶標(biāo)記的DNA探針雜交，檢測(cè)出與探針同源的限制性片段，其片段的數(shù)目和大小的變化使每株分離株呈特征性帶型。PCR雙脫氧指紋圖譜是由PCR-SSCP和雙脫氧DNA測(cè)序結(jié)合產(chǎn)生的一種方法，主要用于結(jié)核菌耐藥型測(cè)定。

2.4 DNA測(cè)序技術(shù) 包括雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法、PCR測(cè)序法及DNA測(cè)序儀的應(yīng)用。焦磷酸測(cè)序法準(zhǔn)確性更優(yōu)于傳統(tǒng)測(cè)定法，是檢測(cè)分枝桿菌特異性核苷酸序列最直接可靠的方法，已成為菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Bao等［12］學(xué)者對(duì)焦磷酸測(cè)序法及常規(guī)分型法、SANGER法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，焦磷酸測(cè)序法鑒別抗酸桿菌的準(zhǔn)確率為98%。目前，DNA序列測(cè)定不僅可鑒別應(yīng)用生化試驗(yàn)難以鑒別的菌種，而且可鑒定某些少見的或需特殊營養(yǎng)成分的分支桿菌菌種，不僅能用于基因突變的檢測(cè)，且能確定突變的性質(zhì)與部位。Che等［13］用序列分析法檢測(cè)了與結(jié)核相關(guān)的IRGM基因多態(tài)性，結(jié)果在其啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)29個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。

2.5 高效液相色譜技術(shù) 根據(jù)離子對(duì)反相高效液相色譜技術(shù)的原理，通過DNA分離柱，對(duì)核酸片段進(jìn)行分離和分析。一些學(xué)者采用此技術(shù)對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥性相關(guān)基因突變進(jìn)行篩選的結(jié)果再次肯定高效液相色譜技術(shù)用于分枝桿菌鑒定的可行性。通過研究耐藥基因的突變點(diǎn)，結(jié)合序列分析，成為簡單高效快速的檢測(cè)結(jié)核病耐藥基因較實(shí)用的方法。變性高效液相色譜技術(shù)是一種新的基因檢測(cè)技術(shù)，在分枝桿菌基因分型鑒定及耐藥基因檢測(cè)方面均有較大應(yīng)用價(jià)值。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和交叉學(xué)科的發(fā)展，目前臨床實(shí)用而頗具開發(fā)價(jià)值的反向雜交技術(shù)已顯示出極大優(yōu)勢(shì)，適合在地區(qū)級(jí)分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室開展。DNA測(cè)序是公認(rèn)的鑒定菌種和檢測(cè)耐藥基因突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，隨著測(cè)序儀不斷改進(jìn)，其應(yīng)用可望普及。此外，液相芯片技術(shù)亦具有良好應(yīng)用前景。結(jié)核病分子生物學(xué)的研究在不同領(lǐng)域已取得較大進(jìn)展，隨著各種技術(shù)不斷完善與發(fā)展，分子生物學(xué)將為結(jié)核病的診斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查等提供更大幫助。

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