體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及抗原表達(dá)分析

劉長(zhǎng)樂(lè)，鄭心田，李廣平，孟恒星，邱錄貴

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211;2中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液病學(xué)研究所)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)培養(yǎng)是體外研究人體大血管內(nèi)皮功能的重要手段。Jaffe等［1］首次從人臍靜脈中分離出ECs并在體外培養(yǎng)成功后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為體外研究ECs的模型受到心血管研究者的關(guān)注。2006年1～3月，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良的酶消化法進(jìn)行HUVECs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定，并檢測(cè)其表面抗原表達(dá)，以用于ECs模型的構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 材料 臍帶，DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清，hVEGF，鼠抗人:CD34IgG、VWF IgG、KDR IgG，羊抗鼠 IgG-FITC/PE，Dil-ac-LDL IgG，F(xiàn)ITC-UEA-1 IgG，DAPI。FACScar流式細(xì)胞儀，包被FN細(xì)胞培養(yǎng)瓶，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，高速低溫離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀KX21型。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的原代培養(yǎng) 取健康產(chǎn)婦分娩后新鮮臍帶20cm，選擇無(wú)夾痕扭曲凝血阻塞的部分向臍靜脈注入0.1%膠原酶溶液至血管充盈，置入37℃無(wú)菌生理鹽水溶液15min后取出沖洗后合并于同一離心管內(nèi)離心。棄上清液加入20%胎牛血清的DMEM/F12(pH 7.0～7.2)重懸細(xì)胞，再用淋巴細(xì)胞分離液離心純化后接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。第2天棄培養(yǎng)液，換入新鮮含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)。每2 d半量換培養(yǎng)液1次，倒置相差顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況，蘇木—伊紅(HE)染色觀察攝片。

1.2.2 HUVECs的傳代培養(yǎng) 在培養(yǎng)第7天，觀察細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS液沖洗25cm2培養(yǎng)瓶后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，收集細(xì)胞—酶溶液，離心重懸細(xì)胞后按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 免疫熒光染色檢測(cè) ①Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè):細(xì)胞爬片后加入丙酮室溫固定，PBS液沖洗干燥后加鼠抗人Ⅷ因子單克隆抗體37℃濕盒反應(yīng)1 h，PBS沖洗干燥后加FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃濕盒反應(yīng)1 h，PBS沖洗干燥后用50%緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察攝片。②攝取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)及吸附荊豆凝集素1(UEA-1)檢測(cè):細(xì)胞懸液在Dil標(biāo)記ac-LDL培養(yǎng)液中孵育4 h，1%多聚甲醛固定，漂洗后與FITC標(biāo)記UEA-1在37℃作用1 h，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗原表達(dá) 收集培養(yǎng)細(xì)胞用加疊氮鈉的PBS-PBA調(diào)細(xì)胞濃度至5×106個(gè)細(xì)胞，加入離心管，200 μl/管，含1 ×106個(gè)細(xì)胞。每管加20 μl FITC/PE標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體避光標(biāo)記30min。細(xì)胞懸于 PBA 中檢測(cè) CD31、CD34、KDR、VWF、CD133陽(yáng)性表達(dá)百分比。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài) 直接觀察HUVECs于培養(yǎng)4～6 h開(kāi)始貼壁，呈單層生長(zhǎng)，互不重疊。形態(tài)由圓形逐漸鋪展呈多角形或短梭形。細(xì)胞邊界清楚，胞質(zhì)豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見(jiàn)雙核。長(zhǎng)至6～7 d融合成片，呈鋪路石狀鑲嵌排列，傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。HE染色胞核呈藍(lán)色、卵圓形，位于中央，大而不規(guī)則，可見(jiàn)明顯的核仁，胞質(zhì)均勻，胞質(zhì)呈粉紅色，胞膜較清楚。

2.2 免疫熒光染色檢測(cè) Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光檢測(cè)熒光顯微鏡下胞質(zhì)中可見(jiàn)大量黃綠色熒光，以磷酸緩沖液替代鼠抗人Ⅷ因子抗體的陰性對(duì)照無(wú)此反應(yīng)。攝取ac-LDL和吸附UEA-1的細(xì)胞功能檢測(cè)，Dil-ac-LDL紅色熒光，熒光強(qiáng)度高;FITC-UEA-1綠色熒光，熒光強(qiáng)度高;雙熒光陽(yáng)性百分比＞80%;胞核呈藍(lán)色熒光。

2.3 表面抗原表達(dá) CD31為 95.73%，KDR為99.66%，VWF 為 99.57%，CD34為 76.82%，CD133為3.48%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，促增殖培養(yǎng)的HUVECs培養(yǎng)4～6 h呈單層貼壁生長(zhǎng)，互不重疊。形態(tài)由圓形逐漸鋪展呈多角形或短梭形。細(xì)胞邊界清楚，胞質(zhì)豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見(jiàn)雙核。長(zhǎng)至6～7 d融合成片，呈鋪路石狀鑲嵌排列，傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛;通過(guò)HE染色細(xì)胞涂片相差顯微鏡下觀察:胞核呈藍(lán)色、卵圓形，位于中央，大而不規(guī)則，可見(jiàn)明顯的核仁，胞質(zhì)均勻，胞質(zhì)呈粉紅色，胞膜較清楚，說(shuō)明HUVECs與 ECs的形態(tài)一致［1］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Ⅷ因子單克隆抗體和FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量黃綠色熒光顆粒。ECs具有吸附ac-LDL的功能，血管炎癥反應(yīng)時(shí)其特征性表現(xiàn)為內(nèi)吞ac-LDL增加［2］。UEA-1是鑒定ECs功能的特異性糖蛋白，其可以與具有內(nèi)皮系表型細(xì)胞胞膜上的L-巖藻糖特異結(jié)合［3］。本實(shí)驗(yàn)顯示HUVECs能攝取ac-LDL，并且結(jié)合UEA-1，免疫熒光結(jié)果＞80%細(xì)胞呈雙陽(yáng)性染色。

鑒定 ECs表型特征的常用標(biāo)志包括 KDR、CD31、CD34、VWF［4］。此外，CD133是分子量為 120 kDa的糖基化多肽，具有造血干/祖細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞表型和功能特征，隨著細(xì)胞分化成熟CD133表達(dá)迅速下降，在分化成熟的ECs不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVECs(第7天)表面抗原表達(dá):CD3195.73%，KDR 99.66%，VWF 99.57%，CD3476.82%，提示HUVECs表達(dá)ECs抗原陽(yáng)性值極高，細(xì)胞純度高，相反CD133抗原的表達(dá)缺失，僅3.84%，說(shuō)明幾乎沒(méi)有原始細(xì)胞和初步分化細(xì)胞，因?yàn)镃D133抗原不被成熟ECs表達(dá)，也借此將原始干細(xì)胞與成熟分化細(xì)胞鑒別開(kāi)來(lái)，此結(jié)果與Peichev等［5］報(bào)道一致。

［1］Jaffe EA，Nachman RL，Becker CG，et al.Cultureof human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by mor phologic and immunologic criteria［J］.J Clin Invest，1973，52(11):2745-2756.

［2］Ceriello A，dello Russo P，Amstad P，et al.High glucose induces antioxidant enzymes in human endothelial cells in culture.Evidence linking hyperglycemia and oxidative stress［J］.Diabetes，1996，45(4):471-477.

［3］Kaushal S，Amiel GE，Guleserian KJ，et al.Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo［J］.Nat Med，2001，7(9):1035-1040.

［4］Blann AD，Taberner DA.A reliable marker of endothelial cell dysfunction，Does it exist［J］.Br J Haematol，1995，90(2):244-248.

［5］Peichev M，Naiyer AJ，Pereira D，et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+)cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］.Blood，2000，95(3):952-958.