人端粒酶RNA組分在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032)

盡管已知高危人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要危險因素，但只有少數(shù)的感染者最終發(fā)展成宮頸癌。最近有研究提出［1］，在宮頸內(nèi)瘤樣病變(CIN)Ⅱ/Ⅲ級進(jìn)展到宮頸癌的過程中，位于3q26位置的編碼人端粒酶的RNA組分(hTERC)基因被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程相關(guān)的基因。我們采用熒光原位雜交(FISH)方法，從基因水平檢測hTERC在正常宮頸、CIN和宮頸癌中的擴(kuò)增情況，為臨床子宮頸癌的篩查、診斷、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2010年12月我院婦科門診、病房和體檢中心行子宮頸癌篩查的患者128例，年齡21～60(42±5.12)歲，均未接受任何治療。進(jìn)行宮頸液基細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)的檢測。按細(xì)胞學(xué)分組，未見上皮內(nèi)瘤變(NILM)38例，未明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)28例，不除外高度上皮內(nèi)病變的不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-H)12例，低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)15例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)41例和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)3例;按組織學(xué)分組分為正常或慢性宮頸炎20例，CINⅠ級28例，CINⅡ級27例，CINⅢ級25例和SCC組28例。20例正常子宮頸建立閾值。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞標(biāo)本采集 采用新柏氏TCT液基細(xì)胞制片技術(shù)，用于細(xì)胞學(xué)診斷。陰道鏡下進(jìn)行組織活檢或?qū)m頸錐切和手術(shù)切除的子宮，標(biāo)本固定后送病理科鏡檢，由其提供最終病理診斷結(jié)果。標(biāo)本采集后，將含宮頸脫落細(xì)胞的TCT保存液(10ml)，離心、酶解、水浴將細(xì)胞滴于載玻片上制片，室溫放置過夜。

1.2.2 FISH操作 玻片洗脫，自然干燥，DAPI復(fù)染，加蓋玻片，暗處放置20min后進(jìn)行顯微鏡下FISH信號觀察。在暗室使用OLYMPUSB×51型熒光顯微鏡，DAPI/FIFC/Texas Red三色濾光鏡激發(fā)觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號，并用Video-Test公司提供的FISH分析軟件進(jìn)行圖像分析。以20個正常宮頸FISH結(jié)果建立閾值，閾值=均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差。本實(shí)驗(yàn)閾值為5.81%。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):計數(shù)信號完整的100個細(xì)胞，其中6個及以上細(xì)胞表現(xiàn)為hTERC拷貝數(shù)增加，即判定為hTERC基因擴(kuò)增陽性。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，比較各級宮頸病變hTERC基因擴(kuò)增，并計算宮頸脫落細(xì)胞hTERC基因檢測宮頸高度病變(CINⅡ/Ⅲ級)和宮頸癌的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。兩個樣本之間的差異用χ2檢驗(yàn)和相關(guān)性分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)分組結(jié)果 NILM、ASC-US、LSIL、ASCH、HSIL及SCC組中hTERC基因陽性表達(dá)率分別為18.42%、36.84%、26.67%、83.33%、85.36% 和100%，隨細(xì)胞學(xué)病變程度增加，hTERC基因擴(kuò)增陽性率增加(P＜0.01)。其中，LSIL與HSIL組、LSIL與SCC組、HSIL與SCC組比較，hTERC基因擴(kuò)增率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。正常涂片、ASC-US與LSIL組兩兩比較，ASC-H與HSIL組比較，hTERC基因陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 病理級別分組結(jié)果 正常對照、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ及子宮頸癌組hTERC基因陽性率分別為5%、21.42%、51.85%、76%和92.86%，隨著子宮頸脫落細(xì)胞病變的進(jìn)展，hTERC基因陽性表達(dá)率逐漸增高(P＜0.01)。hTERC基因擴(kuò)增預(yù)測CINⅡ/CINⅢ級以上級別病變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為73.75%、85.42%、89.39%和76.13%。

2.3 與HR-HPV相關(guān)性 HR-HPV陽性組中hTERC基因的表達(dá)率為69.56%(64/92)，HR-HPV陰性組為5.56%(2/36)，hTERC基因的表達(dá)和HRHPV感染密切相關(guān)(rs=0.794，P＜0.05)。

3 討論

國外陸續(xù)有研究證實(shí)，宮頸癌細(xì)胞系、宮頸癌組織和宮頸癌前病變組織中，均存在hTERC基因擴(kuò)增，hTERC基因的異常拷貝數(shù)增加可能是宮頸癌形成的早期事件［2］。

本研究結(jié)果顯示，隨著宮頸病變的級別升高，hTERC陽性表達(dá)率逐漸升高，且CINⅢ及宮頸癌中hTERC陽性表達(dá)率顯著高于慢性宮頸炎、CINⅠ和CINⅡ，與其他國家學(xué)者報道一致［3，4］。提示 hTERC在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，在一定程度上可反映宮頸病變的惡性程度，為臨床預(yù)測提供依據(jù)。在子宮頸癌及癌前病變中，HR-HPV感染后，其致癌基因E6、E7編碼的原癌蛋白可上調(diào)端粒酶活性，在HPV激活端粒酶的過程中，hTERC亞單位表達(dá)上調(diào)可能是端粒酶的激活的主要途徑。隨著宮頸病變程度的進(jìn)展，HR-HPV的感染逐漸升高，hTERC基因的表達(dá)也隨之上升，兩者趨勢一致。從本研究中看到，HR-HPV陽性組中hTERC基因的表達(dá)率明顯高于陰性組，說明hTERC基因的表達(dá)和HR-HPV感染密切相關(guān)。

在臨床上，對CINI及以下病變的治療原則完全不同于CINlI及以上病變。后者需手術(shù)治療，而前者僅需定期隨訪或采取物理治療等姑息治療。在評估子宮頸病變的進(jìn)展中，hTERC有望成為一項(xiàng)重要指標(biāo)，對于子宮頸癌前病變的早期診斷和篩查具有重要的臨床價值［5］。通過本研究結(jié)果，hTERC基因的檢測在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的診斷及評估進(jìn)展預(yù)后方面具有一定價值，可以作為宮頸癌的遺傳學(xué)診斷手段，并有望成為宮頸癌治療的新靶向［6，7］。

［1］Hopman AH，Theelen W，Hommelberg PP，et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression ofuterine cervical dysplasia to invasive cancer［J］.J Pathol，2006，210(4):412-419.

［2］Ferenczy A，F(xiàn)ranco E.Persistent human papillomavirus infection and cervical neoplasia［J］.Lancet Oncol，2002，3(1):11-16.

［3］Nakano K，Watney E，McDougall JK.Telomerase activity and expression of telomerase RNA component and telomerase catalytic subunit gene in cervical cancer［J］.Am J Patho，1998，153(3):857-864.

［4］Heselmeyer HK，Janz V，Castle PE，et al.Detection of genomic amplification of the human telomerase gene(TERC)in cytologic specimens as a genetic test for the diagnosis of cervicaldysplasia［J］.Am J Patho，2003，163(4):1405-1416.

［5］Heselmeyer-Haddad K，Sommerfeld K，White NM，et al.Genomic amplification of the human telomerase gene(TERC)in pap smears predicts the development of cervical cancer ［J］.Am J Patho，2005，166(4):1229-1238.

［6］Parkinson EK，Minty F.Anticancer therapy targeting telomeres and telomerase:current status［J］.BioDrugs，2007，21(6):375-385.

［7］Fleisig HB，Wong JM.Telomerase as a clinical target:current strategies and potential applications［J］.Exp Gerontol，2007，42(1-2):102-112.