Western blot方法檢測胞質中細胞色素C含量的改進

劉亞君，修瑞娟

(中國醫學科學院微循環研究所，北京100005)

Cyt C是一種水溶性的小分子蛋白質，分子量約為15 kD。正常情況下，Cyt C位于細胞線粒體內膜的嵴上，是線粒體電子傳遞鏈的組成部分，負責將電子由復合物Ⅲ傳遞到復合物Ⅳ［1］。Cyt C從線粒體釋放到胞質，是線粒體途徑細胞凋亡發生的關鍵步驟［2］。因此胞質中Cyt C的檢測對于組織細胞凋亡及線粒體損傷的評價具有重要意義。然而，由于Cyt C分子量較小，Western blot轉膜過程不好控制，給科研工作者帶來一定困難。本研究通過提取大鼠小腸上皮細胞胞質蛋白，對比經過不同時間轉膜后，Cyt C條帶的深淺來確定最佳轉膜時間，旨在為Western blot檢測胞質中Cyt C提供一種新的實驗條件。

1 材料與方法

1.1 樣品制備 成年Wistar大鼠麻醉后，取小腸。載玻片刮取小腸上皮細胞。按1∶8比例加入勻漿液［250 mmol/L蔗糖，20 mmol/LHEPES-KOH，10 mmol/L KCl，

1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1.8 mg/ml碘乙酰胺，1 mmol/L PMSF，10 μl/ml Protease inhibitor cocktail(P8340，Sigma)］，勻漿管中上下勻漿30次。4℃1 000 g離心10 min，取上清。4℃3 000 g離心15 min。取上清，4℃10 000 g離心15 min，將上清分裝，－80℃儲存備用。

1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 樣品按照Bradford法蛋白定量。采用15%SDS-PAGE分離膠，3%SDS-PAGE成層膠。取20 μg蛋白樣品液于點樣孔中，電壓150 V，電泳30 min。

1.3 電轉移及麗春紅染色 取22 μm硝酸纖維素膜(NC膜)，電壓100 V，分別電轉移15、30、60、90、120 min。將每個時間點的NC膜浸入1%麗春紅溶液中顯色3 min，蒸餾水沖洗。

1.4 抗原抗體反應及顯色 將麗春紅染色的膜浸入1%吐溫20、5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜數次。加入1∶300 Cyt C抗體(Pharmingen)，4℃ 孵育過夜。洗膜后加入1∶2 000辣根過氧化物酶標記的二抗(Santa Cruz Biotech)，室溫孵育1 h，洗膜數次。將膜放入顯色液中(Pierce)，室溫下孵育5 min。放射自顯影法顯色。

2 結果

2.1 麗春紅染色結果 見插頁Ⅱ圖5。隨著電轉移時間的增加，經麗春紅染色的NC膜上蛋白質條帶逐漸加深，電轉移120 min時染色最深。

2.2 Cyt C放射自顯影成像結果 大鼠小腸上皮細胞胞質蛋白經不同時間電轉移后，于15 kD處出現一條特異性條帶，見插頁Ⅱ圖6。由圖6可見，Cyt C條帶顏色在30 min和120 min較深，以120 min電轉移得到的條帶顏色最深。

3 討論

Western blot方法作為一種敏感的蛋白質半定量技術，在分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中得到了廣泛應用。

Cyt C是小分子蛋白，在Western blot的轉膜過程中容易丟失，而關于通過Western blot檢測細胞色素C的文獻大多沒有詳細的轉膜電壓及轉膜時間介紹。在轉膜過程中，轉膜時間隨蛋白質分子量大小而變化，分子量小的蛋白質，其轉膜時間相對較短［3］。本實驗中我們選擇15、30、60、90、120 min 5個轉膜時間點來對比轉膜蛋白條帶及Cyt C條帶的深淺，以確定最佳轉膜時間。結果發現，NC膜經麗春紅染色后，隨著轉膜時間的增加，蛋白條帶顏色加深，15 min時最淺，120 min時最深。而Cyt C條帶并不是隨著轉膜時間的增加而加深，出現了先增加(30 min)，后減少，再增加(120 min)的趨勢，而在120 min時最深。我們分析，在轉膜過程中，隨著時間的增加，轉移到NC膜的總蛋白增多，而對于小分子的Cyt C，雖然當轉膜時間超過30 min后，一部分Cyt C穿過NC膜進入轉膜液，但隨著時間的延長，NC膜上Cyt C增加的量大于進入轉膜液的Cyt C的量，因此保留在膜上的Cyt C逐漸增加，從而當轉膜時間為120 min而不是30 min時，Cyt C的條帶最深。

通過本實驗，我們得出結論，Cyt C雖然是小分子量蛋白，但Western blot的最佳轉膜時間并不需要減少，相反要增加到120 min才能得到最深的條帶。

［1］Ow YP，Green DR，Hao Z，et al.Cytochrome c:functions beyond respiration［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(7):532-542.

［2］Christophe M，Nicolas S.Mitochondria:a target for neuroprotective interventions in cerebral ischemia-reperfusion［J］.Curr Pharm，2006，12(6):739-757.

［3］鄭維.漢英醫學分子生物學實驗方法［M］.北京:中國協和醫科大學出版社，2005:373-379.