近紅外光譜技術對膠質瘤大鼠優化散射系數的研究

郭 凱，楊天明*，錢志余，張立國，劉華亭

(1東南大學附屬中大醫院，南京210009;2南京航空航天大學)

膠質瘤起源于神經外胚層，是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤(約占30%)。目前膠質瘤的無創定位方法主要是MRT、CT、PET，然而膠質瘤呈浸潤性生長并與腦組織無明顯分界，傳統的檢測方法所檢測到的腫瘤邊界隨著術中腦位置變化和腦脊液改變而變化，因此，為盡可能切除腫瘤細胞需要開發一種新的檢測方法來更好地定位腫瘤范圍［1，2］。近紅外光譜技術將空間分辨率提高到單細胞分子水平，以無創或微侵襲、準確度高的特點逐漸應用于臨床腫瘤的診斷。本實驗于2010年3～11月利用近紅外光譜采集系統實時在位采集C6膠質瘤大鼠的優化散射系數，通過對其分析來判斷腦組織類型，為膠質瘤研究提供一種新的實時診斷技術。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料 江灣I型C動物立體定向儀，微創近紅外組織參數測試系統，特制的Y型雙光纖微探頭，鹵素光源，光譜儀，自動步進系統，MID－7604步進電機驅動器，PCR－7344控制器，計算機及相關軟件。

1.2 細胞與動物 大鼠C6膠質瘤細胞(購自中國科學院上海細胞庫)，培養于5%CO2、37℃培養箱，培養基為加入15%馬血清及2.5%胎牛血清的F－12K培養液。在細胞對數生長期大約滿85%時，以0.25%胰酶消化，收集消化液，離心后去除上清液，F－12k液洗2次后制成細胞懸液，調節細胞濃度至1×107～1 ×108/10 μl，置于 33 ℃恒溫搖床待接種。苔盼藍排斥實驗檢測細胞活力＞95%。選取健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(購自南京青龍山實驗動物養殖中心)40只，體質量250 g，雌雄不限，隨即選取20只建模，另外20只作為正常對照組。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠質瘤大鼠模型的建立及鑒定 大鼠術前12 h禁食禁水，麻醉前30 min肌肉注射阿托品0.05 mg以抑制呼吸道分泌，并在實驗過程中每小時肌肉注射阿托品0.05 mg維持。腹腔注射1%戊巴比妥進行麻醉，體溫控制在37.5℃。麻醉后將大鼠固定于江灣Ⅰ型立體定向儀上，暴露前囟，以前囟為原點，向后1 mm、中線向右旁開3.0 mm，用牙科磨鉆打一直徑1 mm小孔。微量進樣針將10 μl細胞懸液緩慢注入硬腦膜下5 mm處的腦組織中，停針5 min后退針，骨蠟封閉骨孔，清洗切口后縫合。常規飼養14 d后將大鼠用常規劑量戊巴比妥鈉麻醉，用7.0 T德國bruker公司生產實驗小動物專用磁共振儀行平掃。

1.3.2 膠質瘤大鼠的優化散射系數測定 將膠質瘤組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定于立體定向儀框架，將三維坐標調零。常規消毒后切開頭皮約1.0 cm，剝離骨膜，用牙科磨鉆在原建模時的骨孔處打一直徑3 mm的小孔，利用生物組織近紅外光譜自動測試系統，在骨孔處進行近紅外光學參數測量。微創光纖探頭以硬腦膜為測試零點，并在立體定向儀的定位和步進電機控制下開始活體在位測量相關參數(測量步長0.1 mm，測量深度約6 mm)。測量結束后緩慢退出近紅外探頭，鉆孔使用骨蠟覆蓋，常規縫合傷口，整個過程在超凈工作臺內進行，術后無需抗生素防治感染，術后對大鼠行MRI掃描。掃描后麻醉處死大鼠，取腦固定于10%福爾馬林溶液24 h以上，石蠟包埋，切片，HE常規染色。正常對照組大鼠的優化散射系數測定步驟同上。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組內行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MRI結果 正常對照組大鼠腦組織可以清晰看出微創光纖探頭從硬腦膜開始經皮層、白質然后到達基底節區。膠質瘤腦組織可看到膠質瘤呈橢圓形侵犯整個右側基底節區域及白質部分，并越過中線擠壓左側基底節區域的腦組織而且伴有腦水腫。

2.2 HE染色結果 膠質瘤大鼠處死后取腦切片行HE染色，左側藍染區域可見C6膠質瘤細胞聚集，右側淡染區域為正常組織并明顯可見C6膠質瘤細胞浸潤。

2.3 優化散射系數測量結果 膠質瘤大鼠的優化散射系數一維曲線較為平直、穩定。在波長690 nm處對照組和C6膠質瘤組優化散射系數分別為(19.86±0.86)、(17.69±1.70)cm－1(P ＜0.05)。

3 討論

近紅外光譜技術是近幾年發展的一種檢測組織結構性質和動態功能的新技術。目前應用于多種病理生理狀況下腦組織的監測，但是大多是用于監測腦組織血流動力學改變或腦氧代謝，用于腦組織類型的精確識別及病理情況下檢測的研究較少。楊天明等利用近紅外光譜技術通過探頭穿刺過程中的近紅外光反射系數R推算腦組織光學參數，證實了腦灰質與腦白質間光學特性有差異。相對于正常腦組織，腦膠質瘤含有較低的脂質及大量的髓鞘增生［1］。腫瘤的生物學行為受諸多因素影響，如瘤體的血管生成和能量代謝等。瘤體的形成過程中，血管生成因子過度表達，血管生成迅速，部分管壁不完整甚至出血壞死［3］。而腫瘤的能量代謝分為有氧代謝和無氧代謝，Ⅱ～Ⅲ級C6膠質瘤多為有氧代謝，能量代謝率較高［4］。因此，當腦組織結構及組成成分發生變化時對光的散射特性也會出現變化，優化散射系數可反應出這種變化。優化散射系數既是組織結構的固有光學特征，又能反映與神經元活動相關的變化，且受組織內血流量、血紅蛋白及水含量等影響小，與吸收系數相比數值相對穩定，宜作為組織定位時的特征參數。在高散射介質的生物組織中(如腦組織)優化散射系數遠大于吸收系數，故優化散射系數更穩定，對變化更敏感。

本實驗我們用特制的內置雙光纖微針管樣探頭［5，6］微創實時在位監測C6荷瘤鼠腦基底節區腫瘤的優化散射系數，并與對照組比較，結果表明C6荷瘤鼠基底節區腫瘤的優化散射系數明顯低于對照組。由此證實近紅外光譜技術對膠質瘤的診斷具有安全可靠、連續實時、便捷、低成本、無創、操作時程短和對人體生理狀態影響小等優點，具有較高的應用價值。

［1］Amharref N，Beljebbar A，Dukic S，et al.Brain tissue characterisation by infrared imaging in a rat glioma model［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1758(7):892－899.

［2］Krafft C，Sobottka SB，Schackert G，et al.Near infrared Raman spectroscopic mapping of native brain tissue and intracranial tumors［J］.Analyst，2005，130(7):1070－1077.

［3］ Tuettenberg J，Friedel C，Vajkoczy P.Angiogenesis in malignant glioma－－a target for antitumor therapy［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2006，59(3):181－193.

［4］Pasdois P，Deveaud C，Voisin P，et al.Contribution of the phosphorylable complex I in the growth phase－dependent respiration of C6 glioma cells in vitro［J］.J Bioenerg Biomembr，2003，35(5):439－450.

［5］錢志余，陳仁文，顧月清，等.生物組織光學參數:優化散射系數(μ’s)的實時在位測定［J］.南京航空航天大學學報，2004，36(3):369－372.

［6］錢志余，顧月清，劉漢莉，等.實時在位測定大鼠腦組織優化散射系數(μ’s)的技術研究［J］.中國醫學物理學雜志，2005，22(2):463－465.