炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子在急性腦缺血模型大鼠腸道細(xì)菌移位中的作用

劉 菁，王燕斌

(1華北電網(wǎng)有限公司北京電力醫(yī)院，北京100073;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

大量的研究表明，嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、重癥胰腺炎、急性腦血管病等應(yīng)激狀態(tài)下，患者的腸黏膜屏障(IMB)功能常發(fā)生變化，腸黏膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)菌移位，形成腸源性感染，是誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)的根本原因［1］。我們?cè)谇捌诘难芯恐幸灿^察到急性腦缺血大鼠IMB的應(yīng)激性變化［2］，但這一損傷發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚。2010年2～8月，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)急性腦缺血大鼠門(mén)靜脈血內(nèi)毒素(ET)、腫瘤壞死因子 α(TNF－α)以及腸黏膜組織中一氧化氮(NO)水平的變化與細(xì)菌移位關(guān)系的研究，探討急性腦血管病患者IMB功能應(yīng)激性變化的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 64只12周齡健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為腦缺血模型組(模型組)和假手術(shù)對(duì)照組(對(duì)照組)。兩組大鼠分別于術(shù)后6、12、24和48 h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)觀察和測(cè)定，各時(shí)相點(diǎn)均為8只。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血模型的制備 大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h始禁食不禁水，模型組采用Kuge等［3］報(bào)道的線(xiàn)栓模型稍加改進(jìn)。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后(40 mg/100 g)，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切開(kāi)，逐層分離組織，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈近端、頸外動(dòng)脈根部。在左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入尼龍絲，經(jīng)左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。尼龍絲插入深度為(18.5±0.5)mm。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈以固定尼龍絲和防止出血，縫合皮膚，尼龍絲末端暴露在外。模型成功的標(biāo)志為:手術(shù)麻醉蘇醒后，大鼠右側(cè)偏癱，右下肢伸直，站立不穩(wěn)，向一側(cè)轉(zhuǎn)圈。對(duì)照組分離血管后除不插入尼龍絲外其余步驟與模型組相同。

1.2.2 血清ET和TNF－α的測(cè)定 各組動(dòng)物處死前，在無(wú)菌條件下取門(mén)靜脈血1 ml，采用偶氮顯色法鱟實(shí)驗(yàn)定量測(cè)定ET;雙抗體夾心ABC－ELISA法測(cè)定 TNF－α。

1.2.3 腸黏膜NO的測(cè)定 取末端回腸，剔除系膜，清除腸內(nèi)容物后刮取黏膜組織200 mg，按需分別制成10%和1%的勻漿，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，硝酸還原酶法測(cè)定NO。

1.2.4 腸道細(xì)菌移位的測(cè)定 各組大鼠處死前6 h，管飼丫啶橙標(biāo)記的大腸埃希菌(ATCC25922)菌液(1 ml/100 g體質(zhì)量)。按各時(shí)間點(diǎn)活殺動(dòng)物后，在嚴(yán)格無(wú)菌條件下取腸系膜淋巴結(jié)(MLN)、肺、脾、胰、肝、腎各0.1～0.3 g，制成10%的組織勻漿涂片。熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記細(xì)菌是否存在，計(jì)算檢出率。每個(gè)器官各時(shí)間點(diǎn)的檢出率=標(biāo)記菌陽(yáng)性的例數(shù)/該時(shí)間點(diǎn)總例數(shù)(8只);各組細(xì)菌總檢出率=標(biāo)記菌陽(yáng)性臟器總數(shù)/觀察臟器總數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用±s表示;組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ET、TNF－α及NO水平變化 見(jiàn)表1。

表1 兩組ET、TNF-α及NO水平變化(n=8，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

?

2.2 標(biāo)記菌移位情況 對(duì)照組各時(shí)相點(diǎn)僅在MLN、肝和肺檢到少量熒光標(biāo)記菌，術(shù)后 6、12、24、48 h標(biāo)記菌總檢出率分別為2.1%、4.2%、2.1%和0，缺血組各臟器的標(biāo)記菌檢出率顯著升高，術(shù)后6、12、24、48 h標(biāo)記菌總檢出率分別為 11.4%、18.8%、25.0%和12.5%，P均＜0.05。

3 討論

生理情況下，結(jié)構(gòu)完整的腸黏膜由于其完善的屏障功能能有效地阻止腸道內(nèi)細(xì)菌侵入體內(nèi)其他臟器，但在嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)、放化療等應(yīng)激狀態(tài)或免疫抑制時(shí)，腸黏膜首當(dāng)其沖受到影響。本實(shí)驗(yàn)用測(cè)定熒光標(biāo)記大腸桿菌移位的方法來(lái)反映腸黏膜的通透性，結(jié)果顯示，在急性腦缺血后早期，IMB功能已遭受破壞，導(dǎo)致腸黏膜通透性升高，從而使細(xì)菌移位明顯增加。

關(guān)于應(yīng)激造成胃腸黏膜損傷的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，其中腸黏膜的低灌注、氧自由基損傷、細(xì)胞因子作用被認(rèn)為是應(yīng)激性胃腸黏膜病變的三大主要致傷因素。關(guān)于急性腦血管病后缺血缺氧以及氧自由基與IMB功能損傷的關(guān)系我們之前已作過(guò)報(bào)道［2，4］，本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)細(xì)胞因子在這一病理生理過(guò)程中的作用進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)中我們選取了ET、NO、TNF－α作為細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的代表［5～7］。本研究表明急性腦缺血后早期，ET水平即開(kāi)始升高，隨之是TNF－α、NO等炎癥介質(zhì)出現(xiàn)的高峰，之后，ET水平達(dá)到其峰值，同時(shí)標(biāo)記菌的移位率也達(dá)到高峰，這與大多數(shù)研究中ET水平峰值先于細(xì)胞因子峰值出現(xiàn)的結(jié)果有所不同。我們分析認(rèn)為，急性腦缺血后因?yàn)槿毖毖醯纫蛩卦斐蒊MB功能一定程度的損傷，ET開(kāi)始入血，之后激活單核—巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量的TNF－α，以自分泌和旁分泌的方式在局部起作用，從而誘導(dǎo)其他炎癥性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，如 IL－1、IL－6、IL－8 等，擴(kuò)大其生物學(xué)效應(yīng)［8］。而此時(shí)形成的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的高峰，使IMB功能進(jìn)一步受損，隨之而來(lái)的是大量ET的集中入血和腸道細(xì)菌移位，形成循環(huán)中ET的高峰，參與此過(guò)程的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，彼此促進(jìn)相互疊加，如此惡性循環(huán)推動(dòng)了SIRS/MODS的發(fā)生發(fā)展，這基本符合“二次打擊”的理論［9］。

總之，腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官，它不僅是MODS的靶器官，更是MODS的發(fā)動(dòng)者。積極干預(yù)急性腦缺血后腸黏膜的應(yīng)激性變化，維護(hù)IMB功能，防止ET和細(xì)菌移位，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，在阻斷急性腦血管病患者SIRS甚至MODS的發(fā)生，改善其預(yù)后有重要的臨床意義。

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