16S rRNA甲基化酶導致的氨基糖苷類抗生素高水平耐藥研究進展

余方友

(溫州醫學院附屬第一醫院檢驗科，浙江溫州 325000)

氨基糖苷類抗生素可以治療革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌引起的感染，由于氨基糖苷類抗生素具有耳和腎毒性，在臨床上的應用受到一定的限制。氨基糖苷類抗生素具有濃度依賴性快速殺菌作用、與β-內酰胺類抗菌藥物可產生協同作用、細菌的耐藥率低、抗生素后效應較長等優點，它仍是目前臨床常用的藥物，廣泛用于治療革蘭陰性桿菌所致的嚴重感染。在治療嚴重感染時，特別是由多重耐藥菌株引起的嚴重感染時，單獨使用氨基糖苷類抗生素治療時可能療效不佳，常需聯合應用其他對革蘭陰性桿菌具有強大抗菌活性的抗菌藥物，如第三代頭孢菌素及氟喹諾酮類藥物等。

氨基糖苷類抗生素的使用同樣面臨著耐藥問題，近年來，細菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥率不斷上升。細菌對氨基糖苷類抗生素產生耐藥的機制主要由細菌產生氨基糖苷類藥物鈍化酶引起，如N-乙酰基轉移酶、O-磷酸轉移酶及O-腺苷轉移酶[1-4]。氨基糖苷類抗生素修飾酶能夠催化氨基糖苷抗生素的氨基或羥基共價修飾，導致氨基糖苷類抗生素與核糖體的結合減少從而導致耐藥。這些修飾酶通常只作用一種或幾種結構類似的抗生素，不能滅活所有的氨基糖苷類抗生素，如阿米卡星[4]。近年來，發現一類質粒介導的16S rRNA甲基化酶，該酶能夠保護細菌的30S核糖體16S rRNA不被氨基糖苷類抗生素結合，造成對包括阿貝卡星在內的所有氨基糖苷類抗生素耐藥，并且為高水平耐藥[5-8]。本文就16S rRNA甲基化酶導致的氨基糖苷類抗生素高水平耐藥機制的研究進展進行綜述。

1 16S rRNA甲基化酶的作用機制

近年來，革蘭陰性桿菌的核糖體16S rRNA的甲基化已成為一種對氨基糖苷類抗生素產生耐藥的新機制。革蘭陰性桿菌的核糖體30S亞基的甲基化是由新發現的16S rRNA甲基化酶所導致，該酶類似于產氨基糖苷類抗生素的放線菌產生的物質。16S rRNA甲基化酶導致革蘭陰性桿菌對目前臨床上使用的氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，該酶的編碼基因通常位于可轉移的質粒上，具有進行水平播散的潛力，導致攜帶16S rRNA甲基化酶基因的菌株在全世界范圍內快速傳播，給臨床治療造成非常大的困難。16S rRNA甲基化酶特異性地結合核糖體30S亞基氨基酸位點 (A位)，從而干擾蛋白質的合成。

氨基糖苷類抗生素是由放線菌產生，如鏈霉菌和小單孢菌屬。這些放線菌對氨基糖苷類抗生素具有天然的抗藥性[9]。在許多情況下，這種抗藥性的形成是由于核糖體蛋白對16S rRNA基因的A位點上特定核苷酸進行甲基化，妨礙氨基糖苷類抗生素結合到30S核糖體亞基，以免遭到自身產生的氨基糖苷類抗生素的攻擊。產氨基糖苷類抗生素的放線菌對氨基糖苷類抗生素的天然耐藥是一種自我保護的方式，這種保護機制被認為不存在于臨床相關的其它菌種中。然而，2003年在銅綠假單胞菌臨床分離株中發現了質粒介導的16S rRNA甲基化酶，導致對臨床上重要的氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，如阿米卡星、丁胺卡那霉素、妥布霉素和慶大霉素等[7]。自2003年以來，關于這個新出現耐藥機制的研究報道快速增加，世界各地報道了有關16S rRNA甲基化酶的分布及其基因型。

1.1 細菌rRNA的修飾

核糖體是由多種酶蛋白和RNA組成的大分子物質，在細菌中，它是由30S和50S的兩個小亞基構成，前者包含16S rRNA，后者包含23S和5S rRNA。RNA轉錄后的修飾，如核苷酸甲基化，發生在RNA轉錄之后。以前報道的主要是tRNA轉錄后的修飾，但也有rRNA修飾的報道。rRNA甲基化的主要作用可能包括調節rRNA的成熟、穩定rRNA的結構、以及改變翻譯的速率，例如，大腸埃希菌突變體產KsgA(RsmA)不足，則會增加無義突變和移碼突變，最終改變了16S rRNA基因 A位和肽-tRNA解碼的保真度[10，11]。此外，某些轉錄后發生的甲基化會導致抗生素靶位rRNA基因的抗藥性。

1.2 放線菌中16S rRNA甲基化介導的耐藥性

大量的放線菌對自己產生的氨基糖苷類抗生素具有天然的耐藥性，其機制為產生氨基糖苷類修飾酶來滅活氨基糖苷類抗生素和通過產生16S rRNA甲基化酶保護16S rRNA上的30S核糖體亞基導致氨基糖苷類抗生素不能與30S核糖體亞基結合。16S rRNA甲基化酶可導致對多種氨基糖苷類抗生素高水平耐藥。這是一個有效的手段來避免由于自身產生的物質抑制自身的蛋白質合成作用，并且在產氨基糖苷類抗生素的放線菌中廣泛存在[12]。

已經確定16S rRNA基因兩個位點的甲基化可導致氨基糖苷類抗生素不同的耐藥表型[13]，其中一組16S rRNA甲基化酶在A1408位點進行甲基化，如產異帕米星的鏈霉菌[14]；另一組16SrRNA甲基化酶在G1405位點進行甲基化，如產慶大霉素的紫色小單孢菌。16S rRNA基因A1408位點的甲基化導致對卡那霉素和安普霉素耐藥，但對慶大霉素敏感；16SrRNA基因G1405位點的甲基化導致對卡那霉素和慶大霉素耐藥，但對安普霉素敏感。這些甲基化產物位于16S rRNA基因A位點解碼區，氨基糖苷類抗生素可結合到該位點，通過阻斷肽基-tRNA從A位到肽酰-tRNA位點的移位來干擾準確的翻譯[15]。

1.3 16S rRNA甲基化酶介導的革蘭陰性菌耐藥性

ArmA型16S rRNA甲基化酶的編碼基因在法國分離的一株肺炎克雷伯菌中被發現，ArmA蛋白對4，6取代的去氧鏈霉菌類抗生素高水平耐藥[6]。在2003年，日本報道一株銅綠假單胞菌臨床分離株由于產16S rRNA甲基化酶導致對氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，該新出現的蛋白酶被命名為RmtA，與各種放線菌產生的16S rRNA甲基化酶具有中等的相似性，相似度為35%[7]。RmtA在一株氨基糖苷類抗生素敏感的銅綠假單胞菌中使16S rRNA 30S亞基核糖體發生甲基化。當rmtA基因克隆在大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中表達時，發現它的表達產物對所有4，6取代的去氧鏈霉菌類抗生素高水平耐藥，包括慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星。16S rRNA甲基化酶的編碼基因與放線菌產生的甲基化酶基因只有中等的同源性，介于30%和35%之間。RmtA的結構基因與一段基因序列有關，該序列類似于一段位于可轉移的質粒上對汞耐藥的轉座子Tn5041的序列[16]。rmtA胞嘧啶和鳥嘌呤的含量為55%，表明它起源于一些胞嘧啶和鳥嘌呤含量豐富的微生物，包括放線菌。ArmA的結構基因被報道位于具有復合功能的轉座子Tn1548中，ArmA的結構基因胞嘧啶和鳥嘌呤的含量為30%，表明它起源于某些胞嘧啶和鳥嘌呤含量較低的微生物[17]。這些研究結果表明，16S rRNA甲基化酶的編碼基因可能從環境中非致病微生物通過水平傳播獲得，但其確切的起源尚不清楚。

迄今為止，共發現了7種16S rRNA甲基化酶，分 別 為 ArmA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE 和NpmA。RmtB在日本分離的粘質沙雷菌中被發現[5]，RmtB與RmtA同源性最高，在氨基酸水平具有82%的同源性。RmtB的編碼基因位于毗鄰Tn3類轉座子的可轉移大質粒上。RmtC是在日本分離的變形桿菌臨床菌株中發現的，與已經報道的ArmA、RmtA和RmtB具有較遠的遺傳系統史[18]，RmtC的結構基因位于靠近一個轉座子介導的被稱為ISEcp1的重組序列，且該甲基化酶基因可以在質粒之間進行轉移[19]。最近發現的16S rRNA甲基化酶RmtD，與RmtA和RmtB具有40%～42%的同源性[20]。RmtD是在巴西分離的一株銅綠假單胞菌中發現的，它同時產SPM-1型金屬-β-內酰胺酶，導致該菌株同時對碳青霉烯類和氨基糖苷類抗生素高水平耐藥[20]。2007年，從日本分離的一株大腸埃希菌中發現另一個新的16S rRNA甲基化酶，NpmA，該酶與鏈霉菌屬的KamA甲基化酶的同源性較低，只有30%，該酶可以導致阿米卡星、慶大霉素、新霉素、核糖霉素等耐藥[21]。最近，在牛體內分離的大腸埃希菌中又發現了一種16S rRNA甲基化酶，RmtE[12]。這些在革蘭陰性桿菌中新發現的16S rRNA甲基化酶基因，導致細菌對所有4，6取代2-去氧鏈霉菌類抗生素高水平耐藥，包括慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星，但不包括4，5取代2-去氧鏈霉菌類抗生素，如新霉素，4取代-去氧鏈霉菌類，如巴龍霉素或鏈霉素。最近，研究發現30S核糖體亞基的16S rRNAG1405位點的甲基化由ArmA所介導[22]，而NpmA可以對30S核糖體亞基的16S rRNA G1408位點N-1進行甲基化[21]。

2 16S rRNA甲基化酶介導的耐藥在臨床分離株中的流行情況

關于革蘭陰性桿菌通過16S rRNA甲基化酶介導的氨基糖苷類抗生素耐藥的數據仍然較少。在日本、中國臺灣、韓國、中國和比利時分離的腸桿菌科細菌中均檢測到RmtB型16S rRNA甲基化酶基因，包括肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、大腸埃希菌和弗氏枸櫞酸桿菌。ArmA最初在弗勞地枸櫞酸桿菌中發現，隨后在肺炎克雷伯菌中發現。在東亞、東歐和西歐多個國家分離的臨床分離株中發現ArmA，包括大腸埃希菌、粘質沙雷菌、陰溝腸桿菌、沙門菌、志賀菌和不動桿菌屬等。盡管在多個地區分離的革蘭陰性桿菌臨床分離株中檢測出16S rRNA甲基化酶，但這些酶的檢出率比較低。日本分離的銅綠假單胞菌臨床株中RmtA檢出率較低，為0.4%[7]；2004年臺灣分離的肺炎克雷伯菌ArmA和RmtB的陽性率只有0.4%和0.04%[8]；韓國在一次調查中只發現一株高度耐阿米卡星的肺炎克雷伯菌攜帶rmtB基因[23]；在比利時分離的腸桿菌科細菌中找到ArmA和RmtB型16S rRNA甲基化酶，但在肺炎克雷伯菌中沒有找到RmtB[24]。有研究表明，北美洲主要以ArmA和RmtB為主，歐洲以ArmA為主，拉丁美洲以RmtD為主[25，26]。亞洲地區16S rRNA甲基化酶基因型別與北美相近。RmtA和RmtD分別只在日本和巴西的銅綠假單胞菌發現并報道[7，27]。在中國，Yu等[28，29]發現溫州地區分離的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株中只能檢測出ArmA和RmtB，且陽性率較高，分別為5.4%和6.2%，兩種菌的檢出率相近。Yu等[30]在分離自我國多家醫院的亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌中發現普遍存在ArmA，且位于染色體上，沒有發現RmtB。Wu等[31]報道在上海瑞金醫院分離的723株大腸埃希菌和202株肺炎克雷伯菌中，ArmA的檢出率分別為0.6%和3.0%，而RmtB的檢出率為分別為2.8%and 1.0%。Zhou等[32]在上海華山醫院分離的氨基糖苷類藥物耐藥的革蘭陰性桿菌中也檢出ArmA和RmtB。盡管在日本發現了RmtA、RmtC和NpmA，但是在亞洲其他國家沒有發現這些酶。中國分離的革蘭陰性桿菌中只檢測出ArmA和RmtB，沒有發現其他型酶。Yu等[28,29]發現大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株中的16S rRNA甲基化酶以RmtB為主，Wu等[31]報道了類似的結果。但是，Yu等[30]在鮑曼不動桿菌中只檢測出ArmA；Zhou等[32]在89株鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌臨床分離株中發現85株ArmA陽性，只有4株RmtB陽性。由此可見，16S rRNA甲基化酶在中國分離的腸桿菌科細菌中以RmtB為主，在非發酵菌臨床分離株中以ArmA為主。雖然在日本發現了較多的16S rRNA甲基化酶型別，16S rRNA甲基化酶基因在日本分離的臨床分離株中的檢出率還是很低，Yamane等[33]在分離自169家醫院的87626株革蘭陰性桿菌中僅發現26株菌攜帶16S rRNA甲基化酶基因。這些研究結果表明，致病革蘭陰性桿菌的16S rRNA甲基化酶基因已在全球范圍內傳播，雖然總的發生率仍偏低。除了在革蘭陰性桿菌中發現16S rRNA甲基化酶，最近有報道在革蘭陽性球菌也發現了16S rRNA甲基化酶，如金黃色葡萄球菌[34]。

除了在臨床分離株中發現產16S rRNA甲基化酶的菌株外，分離自動物的腸桿菌科細菌檢測出16S rRNA甲基化酶，并且16S rRNA甲基化酶的檢出率非常高[35-38]。2007年我國報道從廣州地區的豬腸道內分離的大腸埃希菌和陰溝腸桿菌中檢測產RmtB型16S rRNA甲基化酶菌株，陽性率高達32.0%，且RmtB的編碼基因全部位于可自我轉移的質粒上[38]。大量的氨基糖苷類藥物，包括卡那霉素、慶大霉素、安普霉素和鏈霉素在獸醫藥中應用，這可能作為一種抗生素選擇壓力，導致腸道革蘭陰性菌獲得16S rRNA甲基化酶基因，該基因可能來自環境中非致病性放線菌，它自身就可以產生氨基糖苷類抗生素或類似的16S rRNA基因抑制劑，動物中腸道革蘭陰性菌可以保留16S rRNA甲基化酶基因，并可通過人類食物鏈進行傳播。因此，監測畜牧業養殖環境中16S rRNA甲基化酶介導的革蘭陰性菌對氨基糖苷類抗生素高水平耐藥情況也是同樣重要的。

3 16S rRNA甲基化酶導致氨基糖苷類抗生素耐藥的臨床意義

盡管目前全球范圍內產16S rRNA甲基化酶的革蘭陰性桿菌的流行率較低，但這仍應引起臨床的關注。首先，這些革蘭陰性桿菌對臨床上最常用的氨基糖苷類抗生素呈高水平耐藥，包括慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星，且增加劑量也無效；其次，所有已知的16S rRNA甲基化酶的結構基因與可移動的遺傳因素有關，如轉座子，其中某些已被證明是有功能性的，使其可以水平傳播給其他菌株和物種，armA主要通過轉座子Tn1540轉移，在armA也存在IS26[17，43]。其他類型的質粒介導的16S rRNA甲基化酶基因的轉移也與插入序列有關，如rmtA的周圍序列存在 IS600，rmtC的周圍序列存在 ISEcp1，而rmtD 的周圍序列存在 ISCR[16，26，44]。16S rRNA 甲基化酶基因位于這些可移動的元件中極易導致該基因在質粒之間、質粒與染色體之間及染色體之間發生轉移，造成耐藥基因的快速轉移。最后，這些微生物具有很大潛力通過獲得各種β-內酰胺酶的基因而成為多重耐藥菌株。有研究表明16S rRNA甲基化酶基因可與ESBL基因共同存在于同一菌株中，甚至是同一質粒上[39-42]。Yu等[29]研究發現16S rRNA甲基化酶基因陽性的肺炎克雷伯菌除2株菌外，16S rRNA甲基化酶基因陽性株檢測到ESBL基因，主要型別為 blaSHV-12、blaCTX-M-14和 blaCTX-M-15。在韓國也有類似的報道[23]。除ESBL基因外，16S rRNA甲基化酶基因還通常和AmpC基因、碳青霉烯類酶基因及喹諾酮類耐藥基因等共同存在同一菌株，導致多重耐藥，甚至泛耐藥。RmtD最初在巴西被發現存在于產SPM-1金屬β-內酰胺酶的銅綠假單胞菌中，這兩種基因的共存使其對碳青霉烯類和氨基糖甙類均耐藥。Yu等[28]發現存在于大腸埃希菌中的rmtB下游存在喹諾酮類藥物的外排泵基因qeqA，qeqA與rmtB共存于同一質粒上導致細菌對氨基糖苷類抗生素和喹諾酮類抗生素同時耐藥。

4 16S rRNA甲基化酶介導的氨基糖苷類抗生素耐藥的檢測

檢測16S rRNA甲基化酶介導的氨基糖苷類抗生素耐藥可能會對臨床實驗室構成挑戰。革蘭陰性桿菌通常可以產氨基糖苷類修飾酶，如乙酰轉移酶、核苷轉移酶和磷酸轉移酶類。當單個微生物產生多于1種氨基糖苷類抗生素修飾酶時，它就可能對多種氨基糖苷類抗生素均耐藥。由于16S rRNA甲基化酶對G1405進行甲基化，導致它在體外對除鏈霉素以外的所有氨基糖苷類抗生素高水平耐藥(MIC＞256g/L)。然而，這在臨床實驗室進行常規藥敏試驗時很難辨別，特別是使用自動化藥敏試驗系統只測定接近每種氨基糖苷類藥物折點的MIC值。16S rRNA甲基化酶介導的耐藥的一個特征性是能導致對阿貝卡星高水平耐藥，阿貝卡星是一種衍生于地米卡星的半合成氨基糖苷類，它具有抗金黃色葡萄球菌以及革蘭陰性菌的活性，它在日本目前只用于治療多藥耐藥的金黃色葡萄球菌感染[45]。然而，阿貝卡星不容易獲得的。當某一株腸桿菌科或葡萄糖非發酵菌株對多種氨基糖苷類抗生素耐藥時，就可以使用慶大霉素、丁胺卡那霉素和阿米卡星的紙片擴散試驗進行檢測。如果沒有或只觀察到較小的抑制環，那么就可懷疑16S rRNA甲基化酶的存在。Yu等[28，29]發現所有產16S rRNA甲基化酶株對慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星呈高度耐藥，MIC值都≥256mg/L，在MIC值低于256mg/L的菌株中沒有檢測出16S rRNA甲基化酶。所有耐阿米卡星的菌株同時耐慶大霉素和妥布霉素，阿米卡星預示對慶大霉素和妥布霉素的敏感性。絕大多數的阿米卡星耐藥菌株攜帶質粒介導的16S rRNA甲基化酶基因，且阿米卡星敏感的菌株中沒有檢測出16S rRNA甲基化酶。因此，阿米卡星是篩選16S rRNA甲基化酶基因的理想藥物，當阿貝卡星耐藥，特別是當阿米卡星MIC值≥256mg/L或無抑菌圈時，提示該細菌可能產16S rRNA甲基化酶。使用阿貝卡星能夠提高該試驗的陽性預測值達到90%，相比只用丁胺卡那霉素，陽性預測值只達到約60%[23]。另外，如果使用氨基糖苷類抗生素的MIC值，那么出現256μg/mL的臨界值時會提高陽性預測值。目前，PCR是唯一的確證方法。可以使用多重PCR法檢測腸桿菌科和不動桿菌屬中的armA,rmtB和rmtC，以及銅綠假單胞菌中的rmtA和rmtD。

總之，氨基糖苷類抗生素的耐藥問題越來越嚴重，特別是近年來出現的16S rRNA甲基化酶導致的耐藥性更嚴重，臨床實驗室應加強對氨基糖苷類抗生素耐藥菌株的監測，預防耐藥株的播散。

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