核磁共振內標法定量分析肝素鈉中多硫酸軟骨素

1引言

肝素鈉是一種由葡萄糖胺，L艾杜糖醛苷、N乙酰葡萄糖胺和D葡萄糖醛酸交替組成的黏多糖硫酸脂鈉鹽，是臨床大量應用的抗凝血藥。研究證明，肝素鈉還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等多種生物學功能。2008年初，歐美各國發生了肝素鈉注射液事件，致使81人死亡。隨后，美國FDA應用核磁共振方法在肝素鈉原料藥中定性查出雜質多硫酸軟骨素（OSCS），并認為OSCS是引起用藥異常的雜質。肝素與OSCS均屬于黏多糖硫酸脂聚合物，分子量分布都有一定寬度，且結構及性質相似，因此，常規的化學和生物檢測方法很難區分\\。目前，國外普遍采用核磁共振氫譜\\和毛細管電泳方法\\分析OSCS；國內將多糖全水解，然后衍生，采用液相色譜法分析 \\。但上述方法都具有局限： 液相色譜法樣品前處理復雜，水解時間長（4 h），且肝素與OSCS水解產物基本相同，標定物只是在量上存有差別；毛細管電泳法測試時間長（每個樣品上機時間1 h）；而核磁共振氫譜方法大多用于常量定性分析。隨著核磁共振儀器分辨率的提高、價格的降低和單次測試成本降低，核磁共振氫譜定量分析在工業大樣本測試中得到發展，但靈敏度與色譜相比仍有差距，特別是對高聚物、多糖類（鑒別肝素中OSCS雜質）等樣品（結構相似、分子量有一定分布）的定量分析，鮮見報道。

2實驗部分

2.1儀器與試劑Avance 500型核磁共振譜儀（德國Bruker公司），5 mmBBO探頭；AL204型分析電子天平（瑞士梅特勒公司），感量0.1 mg； HP3DCE毛細管電泳儀（美國Agilent公司）；融熔石英毛細管（50 μm×56 cm，未涂膜，美國Beckman公司）; 超純水儀（美國Millipore公司）。肝素鈉標準品： CAT.NO.1304038 USP ROCKVILLE.MD LOT FOH210，OSCS標準品： CAT.NO.1133580 USP ROCKVILLE.MD LOT FOI113（美國FDA公司）；D2O（99.8% D，美國CIL公司）；氘代三甲基硅丙磺酸鈉（Trimethylsilylpropionic，TSP，98% D，美國Sigma公司）；H3PO4（廣州化學試劑廠）。

2.2NMR和毛細管電泳（CE）測定條件NMR采樣參數： 1H的共振頻率： 500.03 MHz，脈沖序列（Pulprog）： Zgcppr， 數據點（TD）： 65536， 采樣次數（NS）： 100， 譜寬（SWH）： 9615.385 Hz， FID分辨率（Fidres）： 0.146719 Hz， 采樣時間（AQ）： 3.407940 s， 接收增益（RG）： 90.5， 溫度（TE）： 298 K， 馳豫時間（D1）： 4.00 s， 窗函數（LB）： 1.00 Hz。

CE電泳條件： 使用融熔石英毛細管為分離柱，以36 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 3.5）為電極液，檢測波長200 nm，毛細管溫度25 ℃，分離電壓為25 kV，樣端為負極，壓力進樣，3.45 kPa，進樣時間3 s。

2.3實驗用試液的配制（1）TSP內標液的制備準確稱取TSP 10 mg于50 mL 容量瓶中，用氘代水溶解并定容，制成TSP內標液，備用。（2）肝素鈉標準溶液的配制準確稱取肝素鈉標準品和OSCS標準品各25 mg，分別置于直徑5 mm核磁管中，各加入0.6 mL TSP內標液，超聲5 min，靜置，待溶液澄清均勻即可進行實驗。（3）OSCS標準溶液的配制準確稱取12.5 mg OSCS，加入6 mL TSP內標液，溶解均勻，得到OSCS溶液。（4）含OSCS的肝素鈉梯度溶液的制備準確稱取25 mg 肝素鈉標準品于直徑5 mm 核磁管中，加入0.6 mL OSCS溶液，超聲溶解均勻，得到含5.0%（w/w）OSCS的肝素鈉溶液。準確稱取25 mg肝素鈉標準品于核磁管中，加入0.3 mL OSCS溶液和0.3 mL TSP內標液，超聲溶解均勻，得到含2.5%（w/w）OSCS的肝素鈉溶液。同理配制含1%， 0.5%， 0.2%， 0.1%和0.05% （w/w）OSCS的肝素鈉溶液。

2.4供試品的制備準確稱取肝素鈉精品 25 mg于直徑5 mm 核磁管中，加入0.6 mL TSP內標液，超聲靜置，待樣品完全溶解均勻即可進行NMR測試。準確稱取肝素鈉精品 2 mg，加水制成約2 g/L溶液，即可進行CE實驗分析。

3結果與討論

3.1標準品NMR譜圖及OSCS含量測定方法的建立及氘代溶劑及內標物的選擇肝素鈉、OSCS是一種黏多糖硫酸脂鈉鹽，易溶于水，所以以氘代水（其中氘用于鎖場）為溶劑。本研究的內標物既作為計算樣品含量而設的標定物，又是化學位移數值的標定物。本實驗選擇內標物為氘代TSP。同時，氘代TSP的化學位移（δ）恰好為0，在本實驗中也用其進行化學位移定標，簡化樣品配制的復雜性。肝素鈉和OSCS在δ 3～6之間有大量峰重疊出現，且峰型復雜，它們是各種多糖單元的貢獻，在本區域很難找到合適的單峰用來作為肝素鈉和OSCS的特征峰。肝素鈉在δ 2.04處有一個獨立的單峰，可歸屬為肝素N乙酰胺基的甲基的信號；OSCS在δ 2.15處有獨立單峰，可歸屬為OSCSN乙酰胺基的甲基的信號；此峰是較尖銳的單峰，可分別定義為兩者的特征峰。采用核磁共振分析肝素鈉與OSCS的混合樣品（圖1）。由圖1可見，兩特征峰明顯分開。

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