細菌素PediocinPA-1融合蛋白的表達純化

【摘要】 目的 在原核中表達和純化融合蛋白。方法 IPTG誘導融合蛋白表達，表達的融合蛋白經金屬鎳離子螯合親和層析純化后，用分子篩Superdex G75進一步純化和鑒定。結果 誘導表達后，通過SDS-PAGE分析，融合蛋白主要存在上清中，金屬螯合層析和分子篩純化后，所得融合蛋白的純度大于90%。結論 獲得純化的融合蛋白，為進一步研究和應用奠定基礎。

【關鍵詞】 細菌素；pediocinPA-1；融合蛋白

細菌素為許多乳酸菌產生的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質物質。乳酸菌細菌素分為三大類[1]，pediocinPA-1為Ⅱa類細菌素，為小分子熱穩定多肽，是一類重要的蛋白類抑菌物質，能抑制食物中的腐敗菌和致病菌。本研究采用融合表達的方式，研究細菌素pediocinPA-1在大腸桿菌中的表達，并純化pediocin PA-1融合蛋白，用于檢測重組細菌素的生物學活性。

1 材料與方法

1.1材料大腸桿菌BL21和載體pET32b為Novagen公司產品，分子篩Superdex G75和Ni-NTA純化試劑盒為GE healthcare產品。

1.2方法

1.2.1 融合蛋白的誘導表達 將構建好的重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21，將鑒定的陽性克隆接種于LB液體培養基中，37℃振搖培養過夜。次日以1∶100的比例將培養物接種到LB中，37℃振搖培養2～3小時左右，至OD600達到0.8。加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，繼續培養3小時。取誘導后樣品超聲破碎，離心收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳。

1.2.2 融合蛋白的純化融合蛋白主要以可溶性形式表達，用金屬鎳離子螯合親和層析對可溶性融合蛋白純化，經過超濾濃縮后，用Superdex G75分子篩層析柱進一步純化，先用PBS平衡柱子，平衡后取金屬螯合親和純化的融合蛋白上樣，洗脫，分管收集蛋白峰并電泳分析。

2 結果

2.1重組質粒的酶切鑒定

重組的質粒經kpn I，Hind III酶切后，出現大小約為5.9kb和150bp兩條DNA帶，與表達載體和目的基因片段預期值相符 (圖1)。表明pediocin PA-1基因已正確連接到表達質粒pET32b中。

2.2融合蛋白的誘導表達

經IPTG誘導后收集菌體，進行SDS-PAGE分析。可見在相對分子量19kDa處有較清楚的條帶。超聲破菌后收集的上清和沉淀的SDS-PAGE分析可見，融合蛋白主要存在于上清中，說明融合蛋白以可溶形式表達(圖2)。

2.3融合蛋白的純化

表達的融合蛋白經過親和純化后超濾濃縮，用分子篩Superdex G75精制，溶液pH7.4，取3、4號樣品超濾濃縮(圖3)，使蛋白的濃度達到1mg/ml以上，分裝，凍干后4度保存備用。從SDS-PAGE電泳圖譜可見，純化后僅有一條分子量約19kD的清晰區帶，這一分子量與融合蛋白的分子量相吻合，薄層掃描分析證明，融合蛋白的純度達90%。說明融合蛋白得到了較高程度的純化(圖4)。

3 討論

細菌素的基礎研究和相關的應用研究需要足量的細菌素。大腸桿菌表達系統為細菌素產生的重要途徑，該表達系統在其它細菌素的表達研究方面已有應用。Ray等[2]將pediocin AcH的結構基因或者成熟肽基因克隆到載體pET-3c中，獲得了具有活性的重組細菌素前體或者成熟細菌素。Richard等[3]設計合成divercin V41成熟肽基因，與載體pET-32b中的含有硫氧還蛋白基因的核苷酸序列融合，在大腸桿菌細胞質內表達可溶性的硫氧還蛋白。

細菌素是小分子肽易被酶降解，且不易檢測。pET是一種高效的原核表達載體，它不僅具有強啟動子序列，而且帶有His-tag標簽，用于檢測和純化融合蛋白，還可以改善融合蛋白的可溶性。將成熟piscicolin 126的基因與載體pET-32a進行克隆，在大腸桿菌中高水平表達硫氧還蛋白-piscicolin126融合蛋白[4]。

本實驗將重組質粒pET32b-pediocin PA-1轉化大腸桿菌BL21誘導后，獲得了帶有標簽的小分子融合蛋白多肽，以可溶的形式表達。用金屬鰲合層析和分子篩進行目的蛋白的純化，檢測到分子量19kDa 左右的蛋白條帶，所得目的蛋白的純度大于90%。為下一步研究它的生物學活性奠定基礎。

參考文獻

[1] Cintas LM，Herranz C，Hernandez PE，etal. Review: Bacteriocins of lactic acid bacteria[J].Food Sci Tech Int，2001，7:281-305.

[2] Ray B，Schamber R， Miller KW.The pediocin AcH precursor is biologically active[J].Appl Environ Microbiol，1999，65: 2281-2286.

[3] Richard C，Drider D，Elmorjani K，etal. Heterologous expression and purification of active divercin V41，a class Ⅱa bacte-riocin encoded by a synthetic gene in Es cherichiacoli [J].J Becteriol，2004，186(13):4276-4284.

[4] Gibbs GM，Davidson BE，Hillier A J.Novel expression system for large-scale produc-tion and purification of recombinant class-IIa bacteriocins and its application to piscicolin 126[J].Appl Environ Microbiol，2004，70(6):3292-3297.