液相色譜-串聯質譜法檢測貝類產品中腹瀉性貝類毒素

摘 要 建立了貝類組織中2種腹瀉性貝毒（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）聚醚類毒素-大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）和鰭藻毒素（Dinophysistoxin-1，DTX-1）的高效液相色譜-串聯質譜分析方法。貝類樣品經80%甲醇溶液提取，經正己烷脫脂和HLB固相萃取柱凈化，采用Pursuit C18（150 mm

SymboltB@ 3.0 mm，3

SymbolmA@ m，Varian公司）色譜柱分離，以80%（V／V）甲醇水溶液為流動相等度洗脫，負離子掃描，在多反應監測（MRM）模式下進行定性與定量分析。在4 ～200

SymbolmA@ g/L范圍內線性關系良好，OA和DTX-1的最低定量限均為2

SymbolmA@ g/kg。添加水平在2， 25和50

SymbolmA@ g/kg時的平均回收率大于80%，相對標準偏差小于11%（n＝6）。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜；貝類毒素；大田軟海綿酸；鰭藻毒素；貝類產品

1 引 言

貝類毒素種類多、分布廣、毒性強。貝類毒素檢測直接關系到海產品的食用安全［1］。腹瀉性貝毒（Diarrhetic shellfish poisoning， DSP）是一種藻類毒素，因被人食用后主要產生以腹瀉為主要特征的中毒效應而得名。DSP是一類脂溶性多環醚類天然化合物，主要來源于鰭藻屬（Dinophysis spp.）和原甲藻屬（Prorocentrum spp.）等有毒藻，通過食物鏈傳遞而大量存在于軟體貝類中。食用貝類導致腹瀉的癥狀最早于20世紀60年代出現在荷蘭。20世紀70年代， Yasumoto等[2]發現腹瀉性貝毒。根據毒素的結構，DSP可以分成3類：聚醚類毒素-大田軟海綿酸（OA）和鰭藻毒素（DTX）;大環聚醚內酯毒素-扇貝毒素（PTX）;融合聚醚毒素-蝦夷扇貝毒素（YTX）。此外，大田軟海綿酸的二元醇酯衍生物盡管沒有表現出和大田軟海綿酸同樣的毒性作用，但可以水解生成大田軟海綿酸，因此也應視為此類毒素。OA和DTX-1是蛋白磷酸酶（PP1和PP2A）的有效抑制劑，因此可導致腹瀉、小腸上皮細胞的腹瀉型退化和促進癌變的發展;同時可能影響到DNA復制和修復過程中的酶活性，從而帶來致畸效應[3，4]。目前，已有多個國家或組織制定了貝類水產品中DSP限量標準，范圍為0～200

SymbolmA@ g/kg （OA）。

目前，常用的DSP分析方法主要分為生物檢測和化學檢測法及其它特殊檢測方法，主要包括小白鼠分析法[5～8]、氣相色譜法、液相色譜法[9，10]、液相色譜-質譜聯用法[11，12]、酶活性抑制檢測技術[13]、酶聯免疫法[14，15]、細胞毒性檢測技術等[16，17]。生物檢測技術難于對毒素進行分離檢測。而氣相色譜和液相色譜法技術需要繁瑣的衍生步驟，缺乏準確的定性能力易造成假陽性。隨著LC-MS聯用技術的發展，其在環境分析領域的應用越來越廣。液相色譜優越的分離能力與質譜強大的定性定量功能相結合，可以克服其它方法定性不準確的缺點。Draisci[11]和Vale[12]等利用液相色譜質譜聯用檢測了貝類中的腹瀉性貝毒，液液萃取凈化，采用一級質譜SIM模式（選擇離子監測）進行定性與定量分析。液液萃取技術試劑用量大，并且操作過程中容易產生乳化現象，采用一級質譜SIM模式定性能力較弱容易產生假陽性。本研究利用固相萃取液相色譜-串聯質譜測定貝類中兩種常見的腹瀉性貝毒OA和DTX-1，固相萃取能很好地去除雜質的干擾，操作簡便，OA的檢測離子對為m/z 803.6/255.1和803.6/563.1， DTX-1的檢測離子對為m/z 817.4/255.1和817.4/113.1。采用二級質譜MRM模式（多反應監測）進行定性分析，選擇兩對離子對定性更加準確，利用其中豐度較高的離子對定量可以提高靈敏度。本方法應用于實際樣品分析，靈敏度準確度均能滿足日常檢測的要求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200L液相色譜串聯質譜儀（Varian公司）；KQ-300E超聲波儀（昆山儀器公司）；氮吹儀（安譜公司）；12位固相萃取裝置（Supelco公司）；Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL，Waters公司）；L-550離心機；Milli-Q純水儀（Millipore公司）。OA和DTX-1（北京伊普瑞斯科技公司），甲醇、丙酮、甲酸、正己烷（色譜純，TEDIA公司），其它試劑均為分析純。實驗用水為Milli-Q超純水。

2.2 樣品處理

稱取2.0 g貝類樣品，加入4 mL 80%（V／V）甲醇溶液，超聲提取5 min，以4000 r/min離心10 min，重復提取一次，合并提取液，用5 mL正己烷脫脂兩次，棄去正己烷層，剩下溶液在45 ℃下氮氣吹至約2 mL用于固相萃取。HLB固相萃取小柱分別用3 mL甲醇、水活化，上樣后用 3 mL水和3 mL 10%（V／V）甲醇水溶液清洗，干燥后用5 mL甲醇洗脫，氮氣吹干后用1mL初始流動相溶解，過0.22

SymbolmA@ m濾膜后上機測定。

2.3 液相色譜-質譜條件

色譜條件： Pursuit C18液相色譜柱（150 mm

SymboltB@ 3.0mm，3

SymbolmA@ m， 美國Varian公司）；流動相A為超純水，B為甲醇；80%（V／V）甲醇溶液等度洗脫6 min，流速0.4 mL/min；進樣體積20

SymbolmA@ L；柱溫為30 ℃。

質譜條件: 電離方式：電噴霧離子源，負離子掃描（ESI－），多反應監測（MRM）；電噴霧電壓－4200 V，保護電壓－600 V；離子源溫度50 ℃；霧化氣為空氣，壓力380 kPa，干燥氣為氮氣，壓力為152 kPa， 干燥氣溫度300 ℃；碰撞氣為氬氣，壓力為0.29 kPa。碰撞能量均為45.5 V。

分 析 化 學第39卷

第1期母清林等： 液相色譜-串聯質譜法檢測貝類產品中腹瀉性貝類毒素

3 結果與討論

3.1 質譜條件的優化

利用注射泵以10

SymbolmA@ L/min流動注射的方式將1 mg/L OA和DTX-1標準溶液注入離子源，分別在正負離子模式下工作，發現這兩種化合物均適宜于負離子模式。利用一級質譜全掃描分析目標化合物的分子離子峰，選取m/z 803.6和817.6為母離子，優化電噴霧電壓、保護電壓、毛細管電壓等。利用二級質譜全掃描收集各自的子離子信息，確定適合定性與定量分析的特征離子對。OA的檢測離子對為m/z 803.6/255.1和803.6/563.1；DTX-1的檢測離子對為m/z 817.4/255.1和817.4/113.1；優化碰撞能量均為45.5 V。隨著碰撞氣壓力的升高，離子響應信號也增強，碰撞氣壓力選擇0.29 kPa。

3.2 提取劑的選擇

生物體常用的提取劑有乙腈、甲醇、丙酮等，本實驗比較了80%乙腈溶液和80%甲醇溶液的提取效率。結果表明，80%甲醇溶液提取效率優于80%乙腈水溶液。在同一加標水平，兩種提取劑提取后的溶液經相同的固相萃取步驟后色譜圖如圖1所示。可能由于兩種提取劑所提取的溶液基質有一定差異，故兩次提取OA和DTX-1保留時間略有不同。

圖1 兩種提取溶提取同一加標水平樣品總離子流圖（加標10

SymbolmA@ g/kg）

Fig．1 TICs of two kinds extraction at the same spiked level （spiked level 10

SymbolmA@ g/kg）

對于貝類樣品，僅采用液液分配很難去除干擾物[11]，并且在液液萃取時容易產生乳化現象，難于破乳，從而影響操作，故將粗提溶液采用正己烷脫脂后再用固相萃取小柱對提取液進一步凈化。本實驗采用HLB固相萃取小柱，萃取時先依次用3 mL甲醇、3 mL水預處理小柱，然后加入預先經正己烷脫脂、氮吹后的樣品溶液，用3 mL純水淋洗鹽分，3 mL 10%甲醇溶液淋洗，然后干燥柱床，用5 mL甲醇洗脫；氮氣吹干后用1 mL 80%甲醇溶液溶解殘渣，超聲溶解后過0.22

SymbolmA@ m濾膜供LC-MS/MS測定。

3.3 方法的線性范圍和檢出限

對于LC-MS分析，基質效應常常是影響準確定量的干擾因素。為消除基質效應對分析結果的影響，將DSP標準溶液逐級稀釋后添加到2.0 g空白基質中做標準曲線，配制成樣品中含量為2， 5， 25， 50和100

SymbolmA@ g/kg的系列。用與樣品提取相同的步驟處理后進行測定，以峰面積與加標濃度繪制標準曲線，X軸代表峰面積，Y軸代表樣品濃度。在2～100

SymbolmA@ g/kg范圍內，OA和DTX-1相關系數Ｒ2分別為0.9962， 09992。分別在空白基質中添加標樣，計算定量下限（LOQ，S/N＞10）， OA和DTX-1的LOQ均為2

SymbolmA@ g/kg。

3.4 回收率與精密度

以貽貝為研究對象，考察了方法的回收率和精密度（表1）。在空白樣中添加了3個水平的DSP標準，按照實驗方法測定回收率和精密度，每個水平重復測定6次。結果表明，在DSP添加量為2， 25和100

SymbolmA@ g/kg時，OA的平均回收率分別為80.2%， 83.9%和90.2%，DTX-1的平均回收率分別為821%， 833%和1020%，相對標準偏差均小于11%。

表1 方法的加標回收率和精密度

Table 1 Recoveries and RSDs of the method

化合物Compounds加入量

Added（

SymbolmA@ g/kg）回收率

Recovery（%）相對標準偏差

RSD（%，n＝6）

大田軟海綿酸 Okadaic acid （OA）2.0 25.0 100.080.2 83.9 90.210.6 9.5 9.2

鰭藻毒素 Dinophysistoxin-1 （DTX-1）2.0 25.0 100.082.1 83.3 102.010.1 9.9 7.1

3.5 樣品分析

利用本方法測定了市售85個貝類樣品，均未檢出DSP。空白樣品及空白加標樣品（2

SymbolmA@ g/kg）色譜圖見圖2。對當地市售的文蛤、貽貝等進行檢測，均未檢出DSP。實驗結果表明， 本方法操作簡便快速，靈敏度高，可以消除假陽性，其回收率及重復性能滿足日常監測的要求。

圖2 空白貽貝樣品（a）和加標2

SymbolmA@ g/kg（b）的色譜圖

Fig．2 Chromatograms of blank mussel sample （a）， and mussel sample spiked with OA and DTX-1 of 2

SymbolmA@ g/kg （b）

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Determination of Diarrhetic Shellfish Poisoning in Shellfishes by

Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

MU Qing-Lin1，FANG Jie1，WAN Han-Xing2，WANG Xiao-Hua1，CAO Liu-Yan1，ZHANG Qing-Hong1

1（Zhejiang Provincial Zhoushan Marine Ecological Environmental Monitoring Station，Zhoushan 31600）

2（College of Environmental Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266100）

Abstract A liquid chromatography-electrospray ionization triple-quadruple tandem mass spectrometric method has been established for the determination of two kinds of diarrhetic shellfish poisoning including okadaic acid （QA） and dinophysistoxin-1（DTX-1）. After being extracted using methanol and water（80∶20，V／V），the solution was extracted with n-hexane to remove lipid components and then cleaned-up by solid phase extraction （SPE） on an Oasis HLB cartridge. The analytes were eluted with methanol-water （80∶20，V／V） on a Pursuit C18 column （150 mm×3.0 mm， 3

SymbolmA@ m）. The quantitative and confirmatory determination of OA and DTX-1 was performed by multiple reactions monitoring （MRM） mode. OA and DTX-1 were determined in the negative ion mode. The calibration curve was linear in the range of 4－200

SymbolmA@ g/L. The quantification limits of OA and DTX-1 were 2

SymbolmA@ g/kg. The mean recoveries at spiked concentration of 2－100

SymbolmA@ g/kg were more than 80% and the relative standard deviations were less than 11% （n＝6）.

Keywords Liquid chromatography tandem mass spectrometry; Shellfish poisoning; Okadaic acid; Dinophysistoxin-1; Shellfish

（Received 13 June 2010; accepted 30 June 2010）