高效液相色譜-三重四級桿質譜分析海洋甲殼動物淋巴和肌肉中的20-羥基蛻皮酮

摘 要 在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血淋巴中加入高油菜素內酯作為內標，用乙腈去除蛋白， 采用高效液相色譜-三重四級桿質譜（HPLC-QqQ MS）對20-羥基蛻皮酮進行分析；對3種甲殼動物（三疣梭子蟹、脊尾白蝦（Palaemon carincauda Holthuis）和口蝦蛄（Oratosquilla oratoria））的肌肉則采用甲醇提取、正己烷脫脂，加入高油菜素內酯作為內標進行分析。在電噴霧電離源正離子模式下，分別取m/z 4452和1091作為蛻皮激素和內標的定量目標離子進行檢測。結果表明，蛻皮激素和內標在Hypersil Gold C18色譜柱上得到良好分離，在0～50 SymbolmA@ g/L范圍內線性相關系數為09978，方法的檢出限為003 SymbolmA@ g/L。三疣梭子蟹血淋巴中蛻皮激素回收率達918%～992%，相對標準偏差小于71%；3種甲殼動物肌肉中蛻皮激素回收率達857%～912%，相對標準偏差小于73%。對采自浙江寧波3批三疣梭子蟹血淋巴及三疣梭子蟹、脊尾白蝦和口蝦蛄的肌肉進行測定，三疣梭子蟹血淋巴中游離20-羥基蛻皮酮平均濃度在243～286 SymbolmA@ g/L范圍內，而3種甲殼動物肌肉中20-羥基蛻皮酮平均含量在48～96 ng/g范圍內。

關鍵詞 20-羥基蛻皮酮; 甲殼動物; 液相色譜-三重四級桿質譜

1 引 言

蛻皮激素是一種類固醇激素，它既存在于無脊椎動物（主要是節肢動物）中，也存在于植物中。節肢動物的蛻皮激素主要是指20-羥基蛻皮酮（20E，圖1A），有關研究多集中于它對人類和各種動物種類的促進生長作用方面[1～3]。臨床研究表明，20E可以很好地促進生物生理代謝，而且不產生副作用。但甲殼類蛻皮激素濃度達到200～400 SymbolmA@ g/L時，會出現外皮加厚等中毒現象[4]。因此，應關注蛻皮激素在甲殼動物中的含量變化，水產養殖過程中應保證生物體內蛻皮激素含量處于合適的范圍內。

目前，檢測生物體內蛻皮激素的方法有薄層掃描法[5]、放射免疫測定法[6]、液相色譜法[7]和液相色譜-串聯質譜法[8～10]等。液相色譜法和薄層掃描法靈敏度較低，而放射化學法無法進行精確定性分析。液相色譜-質譜分析方法靈敏度高，抗干擾能力強，已經應用于哺乳動物及昆蟲體內蛻皮激素的痕量檢測[6，9]，但還未見對海洋甲殼動物淋巴液和肌肉中蛻皮激素的分析報道。本研究利用高效液相色譜-三重四級桿質譜（HPLC-QqQ MS）分析系統，建立了三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血淋巴、3種甲殼動物（三疣梭子蟹、脊尾白蝦（Palaemon carincauda Holthuis）和口蝦蛄（Oratosquilla oratoria））的肌肉中的20E分析方法，檢出限達到003 SymbolmA@ g/L。本方法靈敏、準確，能夠滿足限量分析要求，可用于三疣梭子蟹、脊尾白蝦和口蝦蛄中蛻皮激素的檢驗，為海洋甲殼動物蛻皮等生長發育過程的生理學研究提供了高靈敏分析手段。

2 實驗部分

21 儀器與試劑

TSQ Quantum Access液相色譜-三重四極桿質譜聯用分析系統（美國Thermo FisherScientific公司）；Sep-Pak C18固相萃取小柱和Sep-Pak Silica固相萃取小柱（3 mL，60 mg， 美國Waters公司）。

20-羥基蛻皮酮（20E，圖1a）和高油菜素內酯（圖1b）的標準品（純度＞98%），乙酸（色譜純）均購自美國Sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜純，美國Tedia公司），純水由超純水系統（法國Millipore公司）制備。其它試劑均為國產分析純。

圖1 20-羥基蛻皮酮（a）和高油菜素內酯（b）的結構式

Fig1 Structures of 20-hydroxyecdysone（a） and 22（S）， 23（S）-homobrassinolide（b）

22 實驗方法

221 標準溶液的配制 準確稱取50 mg 20E標準品，以甲醇溶解并定容至10 mL，配制成5 g/L標準儲備液，置4 ℃冰箱中保存。制作工作曲線時，用甲醇將此儲備液稀釋成不同濃度的標準溶液，每份標準溶液中加入高油菜素內酯，使其含量達到100 SymbolmA@ g/L。

222 樣品采集和處理 三疣梭子蟹、脊尾白蝦和口蝦蛄均于2009年11月采自寧波象山港。由于其它生物淋巴液抽取困難，故甲殼動物淋巴液中20E的分析只針對三疣梭子蟹分析。

從三疣梭子蟹的心臟處抽取03 mL血淋巴，加入12 mL乙腈和30 SymbolmA@ L 1000 SymbolmA@ g/L高油菜素內酯，渦旋混合30 s，以12000 r/min 高速離心15 min，上清液旋轉蒸發，用03 mL甲醇-05%醋酸（5∶1，V／V）溶液復溶后進行HPLC-QqQ MS分析。根據樣品中20E的特征離子響應強度與內標物高油菜素內酯的特征離子響應強度比值，用加入內標的工作曲線法求得淋巴樣品中20E的含量。

分 析 化 學第39卷

第1期趙 鵬等： 高效液相色譜-三重四級桿質譜分析海洋甲殼動物淋巴和肌肉中的20-羥基蛻皮酮

準確稱取三疣梭子蟹、脊尾白蝦和口蝦蛄肌肉各約1 g，放入研缽中并加入2 mL甲醇，用剪刀將肌肉盡量剪碎，研磨5 min，倒入超聲波細胞破碎儀塑料管，用6 mL甲醇沖洗研缽3次，合并入塑料管，超聲破碎10 min，以12000 r/min高速離心15 min，取上清液并加入等量正己烷，渦旋混合30 s，然后以12000 r/min 高速離心15 min后棄去上層，重復3次，將溶液旋轉蒸發干，用03 mL 甲醇-05%醋酸（5∶1，V／V）溶液復溶后進行HPLC-QqQ MS分析。用加入內標的工作曲線法求得肌肉樣品中20E的含量。

223 色譜-質譜條件 Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×21 mm×17 SymbolmA@ m，美國Thermo Fisher Scientific公司），進樣量10 SymbolmA@ L，柱溫40℃，流動相為05%乙酸（A）和乙腈（B），流速02 mL/min。梯度洗脫：0～8 min，10%～100% B；8～10 min，100% B；10～12 min，100%～10% B；12～16 min，10% B。

采用電噴霧電離源正離子電離模式，噴霧電壓 3 kV，鞘氣流量 25 L/min，輔助氣流量 5 L/min，離子傳輸毛細管溫度 350 ℃，掃描采用選擇反應監測（SRM）模式。碰撞能量見表1。 采集時間均為02 s，碰撞氣采用氬氣，碰撞氣壓力02 Pa。 Q1和Q3分辨率均設定為半峰寬 07 Da。

表1 SRM模式下獲得的特征碎片離子

Table 1 Characteristic fragment ions obtained by selected reaction monitoring （SRM） mode of LC-（ESI＋）-electrospray ionization-triple quadrupole （QqQ）-MS mode

分析物Analytes

通道1Transition 1

（m/z）碰撞能量Collision energy

（eＶ）通道2Transition 2

（m/z）

碰撞能量Collision energy

（eV）

通道3Transition 3

（m/z）

碰撞能量Collision energy

（eV）

20-羥基蛻皮酮

20-Hydroxyecdysone

4812＞4452

12

4812＞3711

13

4812＞1651

26

高油菜素內酯

22（S），23（S）-Homobrassinolide

4954＞4594

9

4954＞1091

32

4954＞ 3431

16

3 結果與討論

31 質譜離子化條件的選擇和色譜分離

以流動注射方式對1 mg/L 20E和高油菜素內酯的標準溶液進行ESI源質譜分析。分別在正、負離子模式下檢測。20E在正離子模式主要產生3種正離子：[M＋H]＋（m/z 4812）、[M＋Na]＋（m/z 503．2）和[M＋K]＋（m/z 5192） （圖2A）；高油菜素內酯主要產生 [M＋H]＋（m/z 4954）和[M＋Na] ＋（m/z 517）兩種正離子（圖2B）。20-E在負離子模式主要產生3種負離子：[Ｍ－H]－（m/z 4792）， [M＋Cl]－（m/z 5173）和[M＋HCOO]－（m/z 5253）（圖3A）；高油菜素內酯主要產生[Ｍ－H]－（m/z 4933）和[M＋HCOO]－（m/z 5393）兩種準分子離子（圖3B）。對比兩種模式，各目標物正離子信號強度比負離子信號強度高兩個數量級，因此選擇正離子模式作為液質采集模式。在正離子模式下，20E和高油菜素內酯均以[M＋H]＋準分子離子峰信號最強，與文獻[10]報道一致，故選擇各目標化合物的[M＋H]＋作為選擇檢測模式下的母離子。對其進行二級質譜掃描，20E主要產生碎片離子m/z 4452，3711和1651（圖4A）；高油菜素內酯主要產生碎片離子m/z 4594， 1091和3431（圖4B）。其中碎片離子m/z 4452和4594（[M＋H-2H2O]＋）分別是從母離子脫去兩分子水形成的，信號最強，作為定量離子；選取豐度次強的子離子作為各自的輔助定性離子。最后以選擇反應監測（SRM）正離子模式優化錐孔電壓（Tube lens offset）、碰撞能量（Collision energy）等質譜參數，優化后的質譜條件見表1。

圖2 正離子模式下，20E（A）和高油菜素內酯（B）的質譜圖

Fig2 Mass spectrum of 20- hydroxyecdysone（A） and 22（S）， 23（S）-homobrassinolide（B） under positive mode

圖3 負離子模式下，20E（A）和高油菜素內酯（B）的質譜圖

Fig3 Mass spectrum of 20-hydroxyecdysone（A） and 22（S）， 23（S）-homobrassinolide（B）under negative mode

圖4 正離子模式，20E（A）和高油菜素內酯（B）的MS/MS子離子全掃描

Fig4 Mass spectrum of 20-hydroxyecdysone（A） and 22（S）， 23（S）-homobrassinolide（B） by LC-MS2

對于20E的分析，一般采用甲醇[9]、乙腈[10]和水作為流動相，在C18反相柱上進行色譜分離。本實驗

分別以甲醇、乙腈及甲醇-乙腈（1∶1，V／V）為流動相。實驗表明，以乙腈為流動相時，信號響應最強。結合質譜離子化條件的選擇，在流動相的水相中加入乙酸，可以優化峰形，提高[M＋H]＋的離子化效率。乙酸濃度對20E和高油菜素內酯色譜峰的峰形會產生較大的影響。當乙酸濃度低于03%時，色譜峰拖尾現象嚴重。實驗表明，采用05%乙酸可獲得理想的峰形（圖5）。

圖5 標準物和樣品的選擇反應監測離子模式總離子流圖

Fig5 Selected reaction monitoring chromatograms of authentic matter and samples

A 10 SymbolmA@ g/L 20-羥基蛻皮酮和100 SymbolmA@ g/L高油菜素內酯混合標樣選擇反應監測色譜圖（SRM chromatograms of standards）; B． 三疣梭子蟹血淋巴樣品的選擇反應監測色譜圖（SRM chromatograms of haemolymphe sample）; C 三疣梭子蟹肌肉樣品的肌肉的選擇反應監測色譜圖（SRM chromatograms of muscle sample）。1 20-羥基蛻皮酮（20-Hydroxyecdysone）；2 高油菜素內酯（22（S），23（S）-homobrassinolide）。

在上述離子化條件下，采用223節的條件分析，含有標準品和內標的混合樣品在 Hypersil Gold C18色譜柱上可以獲得良好的分離。

32 標準曲線和檢出限

分別配制含1， 5， 10， 20和50 SymbolmA@ g/L 20E及100SymbolmA@ g/L高油菜素內酯的混合標準溶液，采用223節的條件進行LC-MS分析。在0～50 SymbolmA@ g/L范圍內線性方程式為Y＝08013X－01768，相關系數R2＝09978。由于甲殼動物蛻皮激素含量通常很低，均在相應的線性范圍內，故采用此標準曲線對三疣梭子蟹血淋巴和3種甲殼動物肌肉中的蛻皮激素進行定量分析。

對10 SymbolmA@ L 02 SymbolmA@ g/L 20E標準樣品進行分析，測得20E（m/z 4812）定量特征碎片離子（m/z 4452）的信噪比S/N＝18。將對應S/N＝3的標準樣品量作為檢出限，可算出本方法20E的檢出限為003 SymbolmA@ g/L。相比薄層掃描法檢出限314 mg/L [5]、放射免疫法檢出限23 SymbolmA@ g/L[6]、其它高效液相色譜串聯質譜法檢出限在01～10 SymbolmA@ g/L之間[8～11]。由此可見，本方法檢測蛻皮激素的靈敏度很高。

33 樣品前處理過程及方法的回收率和精密度

分析血清樣品中20E時，有研究者采用乙腈去蛋白后直接上機分析[9]；也有研究者采用Sep-Pak C18固相萃取法和Sep-Pak Silica固相萃取法[10]。本研究向940 SymbolmA@ L生理鹽水中分別加入1 mg/L標準品和內標各30 SymbolmA@ L，采用不同前處理方法進行回收率實驗。結果表明，乙腈去蛋白后直接進樣的回收率為918%～992%，相對標準偏差小于71%；Sep-Pak C18柱的回收率為714%～877%，相對標準偏差為131%；過硅膠柱后的樣品不出峰，未檢測到。本研究采用乙腈去除蛋白法提取20E進行液質分析。

對于3種甲殼動物肌肉中20E的提取，考慮到肌肉中脂類對20E測定的干擾，甲醇提取后還需經過正己烷預先脫脂。但實驗發現，由于內標高油菜素內酯的極性相對于20E較低（圖1），大部分也會被正己烷脫除，所以用高油菜素內酯作為肌肉中20E的參比內標并不合適，需要尋找極性與20E更為接近的物質或者20E的同位素內標作為方法的參比內標。在本研究中，為了與血淋巴中20E測定方法盡量一致，同時避免內標也被正己烷去除，所以在測定肌肉中20E時，參比內標高油菜素內酯在正己烷脫脂后加入。向已被甲醇提取過的甲殼動物肌肉殘留物中加入1 mg/L 20E后，重復222過程進行回收率實驗，測得方法的平均絕對回收率在857%～912%范圍內，相對標準偏差小于73%。

34 樣品測定

對3組不同批次的三疣梭子蟹、脊尾白蝦及口蝦蛄進行分析，每批樣品平行測定3次。三疣梭子蟹血淋巴中20E含量為（280±044）SymbolmA@ g/L，（260±053）SymbolmA@ g/L和（243±027）SymbolmA@ g/L。3種甲殼動物肌肉樣品平均值見表2。與節肢動物門中的昆蟲[6，9]及其它甲殼類[12]類似，海洋甲殼動物體內的蛻皮激素隨著生長期不同而不斷變化[4]。由于本實驗樣本均采自冬季，從結果可見，3種甲殼動物體內的蛻皮激素不同批次間并無明顯的統計性差異。

表2 3種甲殼動物肌肉中20E的含量（ng/g）

Table 2 Content of 20-hydroxyecdysone in muscle of three kinds of crustacean（ng/g）（±SD， ng/g）

樣品批次Sample batch

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus脊尾白蝦Palaemon carincauda Holthuis口蝦蛄Oratosquilla oratoria

156±0248±0458±03

274±0454±0496±04

383±0567±0472±02

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Determination of 20-Hydroxyecdysone in Several Marine

Crustaceans by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

ZHAO Peng， XU Ji-Lin， QI Yi-Zhou， CHEN Juan-Juan， ZHU Dong-Ｆa， YAN Xiao-Jun*

（Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology， Ningbo University， Ministry of Education， Ningbo 315211）

Abstract A method based on high performance liquid chromatography coupled with electronspray ionization/triple quadrupole mass spectrometry（HPLC/QqQ-MS） has been established for the determination of 20-hydroxyecdysone in the haemolymph of Portunus trituberculatus and in the muscle of crustacean（Portunus trituberculatus， Palaemon carincauda Holthuis and Oratosquilla oratoria） Homobrassinolide was utilized as internal standard The mass spectrometry was performed in positive mode， using precursor ions at m/z 4452 and 4594 as quantitative ions for 20-hydroxyecdysone and 22（S）， 23（S）-homobrassinolide， respectively The results showed that 20-hydroxyecdysone and 22（S）， 23（S）-homobrassinolide were separated with high efficiency in the selective reaction monitoring（SRM） mode on Hypersil Gold C18 column Linearity of the method was good with correlation coefficients（R 2） of 09978 in the range of 0－50 SymbolmA@ g/L The detection limit was 003 SymbolmA@ g/L The recoveries varied from 918% to 992% for the haemolymph and 857% to 912% for the muscle with the relative standard deviations（RSDs） from 73% and 71%， respectively Using this method， 20-hydroxyecdysone in the haemolymph of Portunus trituberculatus collected in Ningbo China， has been determined with content ranged from 243 to 286 SymbolmA@ g/L; the concentration of 20-Hydroxyecdysone in the muscle of crustaceans（Portunus trituberculatus， Palaemon carincauda Holthuis and Oratosquilla oratoria） were determined from 48 to 96 ng/g The method is a powerful tool for comprehensive analysis of biological sample with exclusive selectivity and excellent sensitivity

Keywords 20-Hydroxyecdysone; Crustacean; High performance liquid chromatography-electrospray ionization-triple quadrupole mass spectrometry

（Received 7 June 2010; accepted 2 September 2010）