應用超高分辨質譜成像技術研究脂類分子在小鼠肝組織中的分布

摘 要 利用基質輔助激光解吸電離-傅里葉變換離子回旋共振質譜儀對磷脂類分子在小鼠肝組織中的分布進行了研究，建立了質譜成像技術檢測小鼠肝組織中磷脂類分子分布的分析方法。以7 g/L α-腈基-4-羥基肉桂酸的50%甲醇溶液（含0.2%三氟乙酸）作為基質，采用正離子采集模式，準確鑒定了5類13種磷脂類分子，其分子量主要分布在700～900 Da之間，且觀察到它們在組織內分布呈現不均勻性。本研究表明，以超高分辨和超高精度的質譜儀開展組織成像研究， 不僅可以探究脂類分子在組織中的分布，而且可以直接準確鑒定相關分子，真正實現分子水平上的組織成像。

關鍵詞 質譜成像；基質輔助激光解吸電離-傅里立葉變換離子回旋共振質譜法；肝組織；磷脂

1 引 言

質譜成像技術[1]是以基質輔助激光解吸電離技術為基礎開發出的一種新型組織內分子成像技術。該技術可以在分子水平上對生物組織內的分子“直接”分析，經過圖像重建軟件獲得組織內分子的定位、定性和定量信息，其檢測對象包括內源性小分子[2～4]、藥物代謝產物[5～8]、多肽[9～11]和蛋白質[12～15]等。脂類分子是一大類重要的生命基礎物質，是生物體質膜結構的重要組成部分，同時作為細胞信號分子參與生物體內的諸多生理活動。研究表明，脂類的異常代謝和分布與疾病相關，如胰島素抗藥性糖尿病、阿爾海默病、癌癥和感染性疾病等[16]。本研究利用基質輔助激光解吸電離-傅立葉變換離子回旋共振質譜儀（MALDI-FTICR MS） 研究了小鼠肝組織中的磷脂類分子的分布及其豐度變化，對分子進行了準確鑒定，真正實現了分子水平上的組織成像分析。2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

9.4 T Apex-UltraTM Hybrid Qq-FTICR MS質譜儀（德國布魯克公司）；Synergy UV超純水系統（美國密理博公司）；CM 1900冷凍切片機（德國萊卡公司）；Image Prep基質覆蓋儀（德國布魯克公司）；真空凍干機（美國西盟公司）。

甲醇（色譜純，美國飛世爾科技公司）；三氟乙酸（TFA，色譜純，美國天地試劑公司）；標準品Peptide calibration standard Ⅱ（德國布魯克公司）；包被氧化銦錫（ITO）載玻片；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）。

6周齡c57小鼠（中國醫學科學院基礎醫學研究所實驗動物中心）。

2.2 標準品及基質溶液的配制

0.5 SymbolmA@ mol/L標準品溶解于125 SymbolmA@ L 0.1% TFA溶液中，振蕩混勻30 s，分裝后置于－20 ℃保存。準確稱取0.105 g CHCA基質兩份，分別溶解于15 mL 50%甲醇和含0.2% TFA的50%甲醇溶液中。

2.3 實驗方法

2.3.1 肝組織樣本的制備 頸椎脫臼法處死小鼠后，立即擇取肝組織，超純水沖洗凈肝組織表面血跡后直接置于50 mL離心管中。離心管底部接觸液氮即開始氣化沸騰，大約保持20 s組織迅速冰結成塊后轉移至于－80 ℃冰箱保存。

2.3.2 組織切片的制備 組織從－80 ℃冰箱轉移至CM 1900冷凍切片機，冷凍切片機操作溫度為－20 ℃。連續獲取相鄰兩個厚度為7

SymbolmA@ m的肝組織切片，分別置于兩個 ITO 載玻片上，然后置于真空干燥機中干燥10 min。利用Image Prep基質覆蓋儀對兩個肝組織切片分別噴灑25 mL 兩種基質溶液。

2.3.3 質譜條件 正離子采集模式；掃描范圍：m/z 100～1500；掃描步長：200 SymbolmA@ m；激光斑點：40 SymbolmA@ m；激光照射點數：50；每張質譜圖累加4次；質量校準：用標準品Peptide mixture進行外標法校正，誤差小于2×10－6。Hystar 3.4和Apex Control 3.0質譜圖采集軟件， DataAnalysis 4.0質譜圖分析軟件， FlexImaging 2.1質譜成像軟件由布魯克公司提供。

2.3.4 數據處理 根據傅立葉變換離子回旋共振質譜儀的一級質譜圖可以準確測定脂類分子的分子量。通過檢索脂類分子數據庫Lipid MAPS（http://www.lipidmaps.org/）鑒定肝組織中的脂類分子。其參數設定為：離子強度大于5000；質荷比容許誤差：±0.005；離子種類：[M＋H]＋， [M＋Na]＋和[M＋K]＋。

分 析 化 學第39卷

第1期劉 輝等： 應用超高分辨質譜成像技術探究脂類分子在小鼠肝組織中的分布

3 結果與討論

3.1 基質條件的優化

以質譜峰個數和強度為優化基質條件的指標，在布魯克公司推薦質譜成像的基質溶液（含7 g/L CHCA的50%甲醇溶液）的基礎上，考察了基質pH值對質譜成像質量的影響。研究表明，添加0.2% TFA的基質溶液可以獲得最佳質譜信號，表明組織表面的酸性環境有利于脂類分子的離子化。

3.2 脂類分子的鑒定

表1為本研究所鑒定的13種脂類分子對應的最強的準分子離子，其分子量主要集中在700～900 Da之間。它們都屬于磷脂類分子，其中包括7種磷脂酰膽堿 （Phosphatidylcholine，PC），1種磷脂酰乙醇胺 （Phosphatidylethanolamine，PE），2種磷脂酰絲氨酸 （Phosphatidylserine，PS），1種磷脂酰甘油 （Phosphatidylglycerol，PG）和2種甘油磷酸脂 （Phosphatidic acid，PA）。磷脂酰膽堿，又稱卵磷脂，嬰兒期其細胞膜含量高達90%，在生命過程中緩慢下降可低至10%[17]。磷脂酰膽堿不僅是細胞膜的主要成分，還參與細胞信號傳導等生理活動。磷脂酰乙醇胺也稱腦磷脂，人體中主要分布于神經系統。有報道稱磷脂酰乙醇胺具有保持膜蛋白正確構象的分子伴侶作用[18]；磷脂酰絲氨酸是大腦細胞膜的重要組成成分之一，對大腦神經信號的傳導及記憶的形成具有重要調節作用[19]。甘油磷脂是機體內含量最多的一類磷脂，它除了構成生物膜外，還是膽汁和膜表面活性物質等的成分之一，并參與細胞膜對蛋白質的識別和信號傳導。

表1 在肝組織中鑒定的磷脂類分子（僅給出最強的準分子離子）

Table 1 Identified phospholipid molecules in mouse liver tissue （the highest quasi-molecular ions in mass spectra are listed）

化合物名（碳原子數∶雙鍵數*）

Compound name（C∶DB）測量質荷比Measured （m/z）理論質荷比

Theoretic （m/z）誤差Error準分子離子

[M＋K]＋ * C: 碳原子數（Number of Carbons）；DB: 雙鍵數（Number of double bonds）; PC: Phosphatidylcholine; PE: Phosphatidylethanolamine; PS: Phosphatidylserine; PG: Phosphatidylglycerol; PA: Phosphatidic acid.

3.3 脂類分子定位分析

圖1是肝組織中某一點的質譜圖和PC（碳原子數∶雙鍵數＝34∶1）、PE（碳原子數∶雙鍵數＝44∶8）、PS（碳原子數∶雙鍵數＝40∶4）、PG（碳原子數∶雙鍵數＝28∶2）及PA（碳原子數∶雙鍵數＝36∶3）5種磷脂分子在小鼠肝組織中的分布信息。由它們在肝組織中的分布圖可知，磷脂分子在肝組織中的分布是不均勻的，這可能是由于肝組織不同區域的組織結構和功能不同造成的。圖2為PC（碳原子數∶雙鍵數＝34∶2）分子的3種準分子離子形式[M＋H]＋、[M＋Na]＋和[M＋K]＋在小鼠肝組織中的分布情況，3種準分子離子形式在肝組織中的分布基本一致。實驗中觀察到不同磷脂分子準分子離子強度的差異可能與磷脂分子的結構有關，如表1所示。研究表明，基于MALDI-FTICR MS的質譜成像技術可以直接在小鼠肝組織中準確鑒定磷脂類分子，并獲得每種磷脂類分子在組織中的分布和豐度的信息。由表1可知，應用FTICR MS，在外標法情況下鑒定的每種磷脂分子的質量誤差均小于0.005 Da。應用串聯質譜技術對表1中的化合物進行了進一步確證。與基于低分辯和中分辨質譜儀的組織成像技術相比，超高分辨、超高準確度的FTICR MS質譜儀可以快速地在組織中發現疾病標志物、研究藥物代謝途徑、代謝物定位，并可實現實時的定性分析。MALDI-FTICR MS的應用減少了化合物的提取及分離步驟，大大簡化了實驗程序，為“直接”在分子水平上觀察組織的病理變化提供了新的技術手段，可以用于研究不同病理狀態下組織的微觀變化，獲得疾病相關分子在組織中的分布、定位及其豐度變化的信息。

圖1 5種磷脂類分子在小鼠肝組織中的分布

Fig．1 Distributions of five phospholipids in mouse liver tissue

圖2 磷脂酰膽堿分子PC（34∶2）的3種準分子離子形式在肝組織中的分布

Fig．2 Distributions of Quasi-molecular ion of PC （34∶2） in mouse liver tissue

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Imaging and Identification of Phospholipids in Mouse Liver Tissue by

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Fourier Transform Ion

Cyclotron Resonance Mass Spectrometry Imaging

LIU Hui， CHEN Guo-Qiang， WANG Yan-Ying， LI Zhi-Li*

（Institute of Basic Medical Science Chinese Academy of Medical Science and School of Basic Medicine，

Peking Union Medical College， Beijing 100005）

Abstract Matrix assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry （MALDI-FTICR MS）-based mass spectrometric imaging （MSI） was applied to profile and identify phospholipid molecules in mouse liver tissues， which were cut into tissue sections （7 SymbolmA@ m） on a cryostat at －20 ℃ and covered with 7 g/L of alpha-cyano-4-hydroxycinnamicacid （CHCA） as matrix in 50% methanol/0.2 trifluoroacetic acid solution. 13 phospholipid compounds， which are classified as 5 different species， phosphatidic acid （PA）， phosphatidylcholine （PC）， phosphatidylethanolamine （PE）， phosphatidylglycerol （PG） and phosphatidylserine （PS）， were accurately identified. Their molecular weights are between 700 and 900 Da. The present results indicate that MALDI-FTICR MS-based MSI is a powerful tool to explore the distribution of disease-related molecules and drug metabolites in tissues.

Keywords Mass spectrometric imaging; Matrix assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry; Liver tissue; Phospholipid

（Received 21 April 2010; accepted 2 July 2010）