基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法區分大腸桿菌糖基轉移酶基因

摘 要 采用高能碰撞誘導解離（CID）-負離子模式基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜技術（MALDI TOF MS）區別wfgD（大腸桿菌O152中O抗原基因簇內）編碼的β-1，3-葡萄糖轉移酶和wfgD（大腸桿菌O77中O抗原基因簇內）編碼的α-1，3-甘露糖轉移酶酶促反應產物-兩個脂寡糖非對應異構體。結果表明: 由高能CID-MALDI TOF 質譜圖中產物離子[B3]/[Y3]豐度比率的差別可明確區別兩個酶促反應產物。并發現碰撞能量為1.0 kV時，碰撞靶氣的壓力變化可影響產物離子[B3]/[Y3]的豐度比率。推斷MALDI-TOF質譜圖中，兩個脂寡糖非對應異構體的磷酸二脂鍵部分和糖苷鍵的裂解依賴于糖基給予體的立體化學。

關鍵詞 脂寡糖；糖基轉移酶；基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜

1 引 言

O抗原是革蘭氏陰性菌外膜的重要成分， 也是免疫系統和抗菌素的主要靶點，O抗原的多樣性對于細菌的致病性及在宿主體內的生存有重要作用[1]。O抗原由寡糖重復單位組成，每個重復單位通常由2～8個單糖組成，O-抗原的多樣性主要源于構成重復單位的單糖種類和糖苷鍵鏈接方式的不同。在Ｏ-抗原生物合成過程中， 糖基轉移酶負責將核苷二磷酸單糖前體上的糖基轉移到延伸中的寡糖單位。

盡管糖基轉移酶非常重要，但由于編碼此類酶的基因之間的同源性很小，根據與其它已知基因的比較，只能判斷一個未知基因是否屬于這類基因，不能判斷其合成的糖苷鍵類別。目前，糖基轉移酶基因功能的明確鑒定主要依賴酶促反應產物化學結構的正確表征。大部分糖基轉移酶酶促反應產物屬于脂寡糖非對映異構體，由于脂寡糖非對映異構體鑒定和區分的困難，在純化制備酶促反應產物的基礎上，應用核磁共振（NMR）技術僅能明確鑒定少部分假定糖基轉移酶的特定功能[2，3]。

理論上，一維和二維NMR技術是現有測定糖鏈結構最常用的方法，也是區分脂寡糖非對映異構體的最有效途徑。但其主要缺點是靈敏度較低，特別是涉及耗時繁瑣的分離純化制備步驟。近年來，基質輔助激光解吸離子化方式的發展和成熟為寡糖非對映異構體的區分提供了技術平臺[4，5]。本研究在采用NMR技術已證明其基因功能的基礎上，以wfgD編碼的β-1，3-葡萄糖轉移酶和wfg D編碼的α-1，3-甘露糖轉移酶酶促反應產物——兩個脂寡糖非對應異構體為研究對象，采用高能碰撞誘導解離（CID）-負離子模式基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS），對兩個脂寡糖非對映異構體進行了區分。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MALDI-TOF-MS基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（4700 Applied Biosystems， MA）。甲醇和乙腈（色譜純，Fisher公司）， α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Fluka公司）， UDP-Glc和GDP-Man（Sigma-Aldrich公司），水為二次蒸餾水。本實驗涉及的菌株、質粒、酶及其它生化試劑參見文獻[2]。

2.2 樣品制備

大腸桿菌O77抗原中wfgD 基因和O152抗原中wfgD基因的克隆、含重組質粒的細菌培養及酶活反應細胞膜提取物的制備按文獻[2]方法進行。由于wfgD和wfgD與細胞膜之間存在相互作用，本研究以H1517（含wfgD或wfgD基因的重組質粒）的細胞膜部分作為酶的來源進行酶促反應。

標準40

SymbolmA@ L反應體系為：1.0 mmol/L 受體GlcNAc-PP-PhU（空白對照以二次蒸餾水替代）， 5 mmol/L MnCl2， 75 mmol/L MES 緩沖液（pH 7）， 5 mmol/L GDP-Man（或UDP-Glc）和10 SymbolmA@ Ｌ細菌膜提取物（含1.0～12 SymbolmA@ g Protein，陰性對照分別以大腸桿菌DH5α和 BL21替代）。37 ℃水浴中反應10 min后，沸水浴中加熱1 min，12000 r/min離心5 min。將上清稀釋200倍后，取0.3 SymbolmA@ L待測液與等體積基質，滴于樣品探頭靶心，室溫干燥結晶后直接分析測試。

wfgD酶促反應產物（Glc-

SymbolbA@ -1，3-GalNAc-

SymbolaA@ -PO3-PO3-（CH2）11-OPh）和wfgD酶促反應產物（Man-

SymbolaA@ -1，3-GalNAc-

SymbolaA@ -PO3-PO3-（CH2）11-OPh）的結構均由GC-MS， 二維H，H-COSY、TOCSY譜和HRMS等方法確認[2]。它們的化學結構分別見圖1和圖2中的插圖。

2.3 MALDI-TOF MS分析條件

基質為α-CHCA，激光器Nd:YAG， 波長355 nm， 反射模式，負離子譜檢測。串聯質譜實驗中， 高能碰撞誘導解離（CID）碰撞小室以空氣為碰撞氣體， 其壓力維持在3.33×10－4 Pa， 碰撞能量1 kV。為方便解析質譜，將預期的酶促反應產物苯氧基十一烷基二磷酸二糖視為五糖（寡糖），苯氧基十一烷基和二磷酸基分別代表一個和兩個糖環。所有碎片應用Domon-Costello命名法識別[6]。

分 析 化 學第39卷

第1期周大煒等: 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法區分大腸桿菌糖基轉移酶基因

3 結果與討論

3.1 兩個脂寡糖非對映異構體的MALDI-TOF MS質譜結果

在負離子模式下，兩個酶促反應產物脂寡糖非對映異構體的MALDI-TOF質譜都有豐度強的準分子離子峰 m/z 789.2133（m/z 789.2134） [M－H]－， m/z 811.2151（m/z 811.2138） [M＋Na－Ｈ]－峰的強度非常弱（圖略）。

3.2 兩個脂寡糖非對映異構體的MALDI-CID 質譜結果

圖1和圖2分別給出了負離子模式下兩個脂寡糖非對映異構體分子離子的二級質譜圖。以wfgD催化反應產物為例，以m/z 789.2133 [Ｍ－Ｈ]－為前驅離子， 觀察到4個源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產物離子為m/z 444.5749 [B3]， 524.6265 [B4]， 462.6034 [C3]和405.5491 [Z3]; 源于糖苷鍵斷裂的產物離子有m/z 241.2966 [Y4]和423.5699 [Y3]; 源于磷酸二脂鍵部分兩個鍵同時碎裂的產物離子有m/z 791739 [PO3]－ 和159.0979 [HPO3PO3]－; 未發現涉及開環的產物離子。 圖1 wfgD催化反應產物的MALDI-CID 質譜圖

Fig．1 MALDI-collision induced disociation（CID） mass spectrum of wfgD product

圖2 wabD催化反應產物的MALDI-CID 譜圖

Fig．2 MALDI-CID spectrum of wabD product

根據圖1和圖2中產物離子相對豐度可較容易區分兩個脂寡糖非對應異構體。wfgD催化反應產物（異頭碳的構型為β， C2直立羥基）的m/z 444.5749 [B3]/m/z 423.5699 [Y3] 的比率為5.5（圖1），遠高于wfgD催化反應產物（異頭碳的構型為

SymbolaA@ ， C2平伏羥基）的比率1.38（圖2）。此外，wfgD催化反應產物含有分子離子脫去一個H3PO4分子的峰m/z 691.1074 [Ｍ－Ｈ－Ｈ3PO4]，而wfgD催化反應產物未見此峰。

在儀器許可范圍內，碰撞能量保持恒定（1 kV）前提下，考察了碰撞室中靶氣（空氣）壓力對上述兩個特征子離子間豐度比率的影響。當CID碰撞室中靶氣壓力維持在1.67×10－4 Pa情況下， wfgD催化產物上述兩個特征子離子豐度的比率（4.0， 圖3a）稍低于wfgD催化產物的比率（5.1， 圖3b）；CID關閉條件下，兩個脂寡糖非對應異構體的源后裂解（PSD）譜中，wfgD催化產物上述兩個特征子離子豐度的比率（4.0， 圖4a）略高于wfgD催化產物的比率（3.0， 圖4b）。研究表明，碰撞室中靶氣壓力對碎裂離子的豐度有很大影響，其機理有待進一步研究。即使碰撞室中靶氣壓力發生變化，根據兩個譜圖（圖3和圖4）中產物離子相對豐度仍可較容易區分兩個脂寡糖非對應異構體。綜上可知，給予體糖環的C2上羥基構型的變化和脂寡糖異頭碳的構型對酶促反應產物脂寡糖磷酸二脂鍵部分和糖苷鍵的穩定性有一定影響。

圖3 wfgD（a）和wabD（b）催化產物的MALDI-CID譜

Fig．3 MALDI-CID spectrums of wfgD（a） and wabD （b） product

圖4 wfgD（a）和wabD（b）催化產物的MALDI-PSD譜

Fig．4 MALDI-PSD spectrums of wfgD（a） and wabD（b）product

3.3 小結

從以上譜圖可見，豐度較大的峰源于磷酸二脂鍵部分的斷裂，糖苷鍵裂解產生的產物離子信號非常弱，未觀測到開環裂解產物離子。CID MALDI-TOF 技術非常適于區分pmol水平的脂寡糖非對映異構體。探索簡單、準確、快捷和靈敏的脂寡糖非對應異構體質譜區分方法，對Ｏ-抗原生物合成路徑中細菌糖基轉移酶特定功能的高通量準確鑒定有重要意義。

References

1 Goldman R C， Hunt F. J. Bacteriol， 1990，172（9）： 5352～5359

2 Brockhausen I， Hu B， Liu B， Lau K， Szarek W A， Wang L， Feng L. J. Bacteriol，2008，190（14）： 4922～4932

3 Yi W， Perali R S， Eguchi H， Motari E， Woodward R， Wang P G. Biochem.，2008，47（5）： 1241～1248

4 Garozzo D， Nasello V， Spina E， Sturiale L. Rapid Commun. Mass Spectrom.，1997，11（14）：1561～1566

5 Maslen S， Sadowski P， Adam A， Lilley K， Stephens E. Anal. Chem，  2006，78（24）： 8491～8498

6 Domon B， Costello C E. Glycoconjugate J，1988，5（4）：397～409

Differentiation of Specific Function of Glycosyltransferase Gene by

Matrix Assisted Laser Desorption-Time of FIight-Mass Spectrometry

ZHOU Da-Wei*1，2，3， LIU Bin1，2，3， WU Jun-Li1，2，3， HU Bo1， QI Yuan-Yuan1

（TEDA School of Biological Sciences and Biotechnology， Nankai University1， The Engineering and

Research Center for Microbial Functional Genomics and Detection Technology， Ministry of Education2，

The Key laboratory of Molecular Microbiology and Technology， Ministry of Education3， Tianjin 300457）

AbstractThe glycosyltransferases（GTs） assembling the O-chain utilize lipid-linked acceptor substrates and nucleotide sugar donor substrates. The difficulty in characterization and discriminate enzymatic products preclude the elucidation of the specific function of putative GTs. In this study， high-energy collision induced dissociation（CID）-negative-ion mode matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI TOF MS） was used to differentiate wfgD（in E. coli O152 O antigen gene cluste） product and wfgD（in E. coli O77 O antigen gene cluste） product. By the mass number analysis， it was found that nearly all of the CID fragment ions were produced by cleavages of diphosphate moiety and glycosidic linkage， while no ring fragmentation was produced. The experimental results demonstrate that the differences in the intensity ratio of fragment ions of [B3] / [Y3] allowed unambiguous differentiation of wfgD product and wfgD product， and when 1 kV is used as the collision energy， the change of collision gas pressure can affect the intensity ratio of fragment ions of [B3]/[Y3]. It was concluded that the abundances of CID fragment ions depended on the stereochemistry of the glycosyl donors in the cleavage of the diphosphate moiety and glycosidic linkage of the lipooligosaccharides（LOS） enzymatic product in MALDI-TOF mass spectra， and CID-MALDI TOF MS analysis of LOS enzymatic product is likely to prove an invaluable tool that can be used to determine the pecificity of O-antigen GT genes.

Keywords Glucosyltransferase; Lipooligosaccharide; Matrix-assisted laser desorption-time of flight-mass spectrometry

（Recieved 28 April 2010; accepted 7 November 2010）