化學發光免疫分析檢測人血清中的癌胚抗原

摘 要 基于辣根過氧化物酶（HRP）催化H2O2氧化3-（4-羥苯基）丙酸（PHPPA），生成能發熒光的3-（4-羥苯基）丙酸二聚體，在乙腈介質中，在增強劑咪唑參與下，與雙[2，4，6-三氯苯基]草酸酯（TCPO）和H2O2反應產生強化學發光。用辣根過氧化物酶（HRP）標記癌胚抗原（CEA）單克隆抗體，通過CEA的雙抗夾心免疫反應，建立了簡單、靈敏和快速檢測人血清中的癌胚抗原（CEA）含量的化學發光免疫分析方法。CEA在1.0～80.0 SymbolmA@ g/L范圍具有良好的線性關系; 檢出限為0.3 SymbolmA@ g/L（S/N＝3），相對標準偏差（n＝11）為3.9%。已成功用于人血清樣品中CEA含量的測定。

關鍵詞 癌胚抗原；酶催化熒光反應；化學發光免疫分析

1 引 言

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是存在于細胞表面的富含多糖的蛋白復合物，分子量約為15000～20000，多在結腸、乳房、肺腺癌和大多數上皮來源的腫瘤中表達。對血清中CEA進行定量檢測，在惡性腫瘤的診斷、評估病變范圍、預測評估療效、監測復發等方面發揮著重要的作用。檢測CEA的常用方法有放免法（RIA）[1]和酶聯免疫法（ELISA）[2]。RIA法敏感性高，但存在放射性同位素損傷和污染、不穩定等弊端，容易對操作人員造成傷害。ELISA法穩定性好且簡便易操作，但敏感性不及RIA法。近年來發展了熒光免疫分析法[3] 、化學發光免疫分析法[4，5]、脂質體免疫分析法[6，7]等，這些方法操作簡便，靈敏度高。

化學發光分析方法與免疫分析相結合已經成為化學與醫學交叉的研究熱點，它具備了化學發光的高靈敏度，也擁有免疫分析方法高特異性的優點，對提高目標物質定量分析的檢出能力具有重要意義［8］。其檢測反應多采用辣根過氧化物酶（HRP）催化對碘苯酚增強的魯米諾同H2O2的化學發光反應。已有多種試劑盒用于臨床檢測。與魯米諾化學發光體系相比，過氧化草酸酯化學發光體系具有更高的發光量子產率，通常可高達30%，且發光持續穩定時間長，能夠通過較長時間成像或者在一定時間內對發光進行積分， 進一步提高測定靈敏度。文獻[9]采用異硫氰酸熒光素或8-苯氨基-1-萘磺酸作為抗體的標記物，對過氧化草酸酯（TCPO）化學發光體系進行免疫分析。由于標記物的測定不存在催化放大作用，反應介質為水溶液，使TCPO化學發光體系的量子產率降低，靈敏度低于熒光免疫分析法。HRP能催化3-（4-羥苯基）丙酸（PHPPA）與H2O2的反應， 可將其作為電子的供體來構建電位免疫傳感器[10]。本實驗用HRP標記CEA抗體，通過雙抗夾心法，在免疫反應完成后，二抗上的HRP催化H2O2氧化PHPPA生成熒光物質 3-（4-羥苯基）丙酸二聚物（PHPPA Dimer）。在乙腈介質中，利用咪唑增強的TCPO-H2O2-PHPPA Dimer化學發光反應進行化學發光測定。此方法簡便、快速、儀器設備簡單，靈敏度高于ELISA法和魯米諾化學發光免疫法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPI-A型多功能化學發光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；ACQ-600超聲波發生器（西安翔達超聲技術工程部）；HC-3018R高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；精密pH計（上海雷池儀器廠）；隔水式電熱恒溫培養箱（上海市躍進醫療器械一廠）；XK96型微量振蕩器（姜堰市新康醫療器械有限公司）。

CEA診斷試劑盒（鄭州博賽生物技術股份有限公司）；乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）；5.0 mmol/L TCPO（自制）的乙腈溶液；1.0 mol/L H2O2-乙腈溶液；1.0 mmol/L咪唑（天津市遠航化學品有限公司）乙腈溶液；0.05 mol/L H2O2緩沖溶液；0.05 mol/L 3-（4-羥苯基）丙酸（PHPPA， Acros Organics公司）緩沖溶液；H2O2，Na2CO3，NaHCO3，NaH2PO4，Na2HPO4，NaOH，H3BO3、Na2B4O7，CH3COONa，三羥甲基氨基甲烷（Tris），HCl，檸檬酸均購自西安化學試劑廠。TCPO和H2O2的乙腈溶液使用時再用相同溶劑稀釋至所需濃度；PHPPA 和H2O2水溶液用pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度。所有試劑均為分析純。水為離子交換水，再經石英蒸餾器亞沸蒸餾制得。

2.2 人血清樣品預處理

樣品來自于新鮮的人體靜脈血液。用干凈的塑料收集新鮮的人血液，在不加入任何絮凝劑的狀態下，在室溫中沉降30 min后，以3000 r/min離心10 min，上層血清用小的樣品收集器收集，儲存在4 ℃冰箱中待用。

2.3 免疫分析方法

采用雙抗體夾心法，將待測樣本或CEA標準抗原加入到已包被有CEA單克隆抗體的96孔反應板中，經過孵育洗滌后，加入HRP標記的抗CEA單克隆抗體。再次孵育，洗滌，拍干。再加入H2O2溶液和PHPPA溶液，振蕩混勻1 min，37 ℃溫育10 min。 圖1 實驗過程

Fig．1 Procedures of proposed method此時二抗上的HRP催化H2O2氧化PHPPA生成發熒光的PHPPA的二聚體。用微量加樣器從各反應孔中各吸取50 SymbolmA@ L反應后的溶液于另一96孔反應板中，加入H2O2（含咪唑）后放入發光檢測器，再加入TCPO乙腈溶液，8 s開始記錄化學發光信號。實驗流程見圖1。

分 析 化 學第39卷

第1期薛 盼等： 化學發光免疫分析檢測人血清中的癌胚抗原

3 結果與討論

在免疫反應完成后的化學發光過程是基于二抗上標記的HRP催化H2O2氧化PHPPA，生成具有熒光的3-（4-羥苯基）丙酸二聚體，然后H2O2將TCPO氧化成高能量的活性中間體，熒光物質3-（4-羥苯基）丙酸二聚體從活性中間體吸收能量而被激發，當從激發態回到基態時產生化學發光。此定量檢測過程依賴于酶催化反應程度和化學發光反應條件。 圖2 HRP酶催化反應和化學發光分析機理

Fig．2 Procedures of HRP-catalyzed reaction and chemiluminescence（CL）mechanism因此，TCPO，H2O2，咪唑和PHPPA的濃度以及溶液條件等因素在實驗中被優化。酶催化反應[11]和化學發光反應機理[12]見圖2。

3.1 HRP酶催化反應條件優化

3.1.1 酶催化反應中緩沖溶液pH值對發光強度的影響 在HRP酶催化反應中，緩沖溶液的pH值對生成的熒光物質3-（4-羥苯基）丙酸二聚體的濃度有較大的影響。在pH 4.0～11.0范圍內， 考察了CH3COOH-CH3COONa （0.05 mol/L），Tris-HCl （0.05 mol/L），磷酸鹽等緩沖溶液的影響。酶催化反應在磷酸鹽緩沖溶液中具有最好的穩定性和最佳發光信噪比。pH 6.0時，具有最大的發光強度。

3.1.2 孵育時間和孵育溫度對發光強度的影響 HRP的活性受到酶催化反應孵育時間和孵育溫度的影響，研究表明，孵育溫度以37 ℃為最佳，當溫度較高和較低時，HRP都表現出了較差的生物活性，所生成的熒光物質3-（4-羥苯基）丙酸二聚體的濃度減小，化學發光強度降低。孵育時間則以10 min為宜，低于10 min化學發光強度較低，孵育時間長于10 min，化學發光強度增加緩慢。

3.1.3 催化反應中H2O2 和PHPPA的濃度對發光強度的影響 PHPPA和 H2O2用 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）稀釋。 圖3 PHPPA濃度對發光強度的影響

Fig．3 Effect of 3-（4-hydroxyphenyl propioate）（PHPPA） concentration on CL Intensity分別在0.1～8.0 mmol/L 和0.1～50 mmol/L范圍內考察了PHPPA和 H2O2濃度對化學發光強度的影響。結果表明，當PHPPA濃度為5.0 mmol/L時，能獲得最大的發光信噪比。PHPPA的濃度高于5.0 mmol/L 時，發光強度下降。信噪比降低（圖3）。H2O2最佳濃度為5.0 mmol/L。

3.2 化學發光條件優化

3.2.1 溶劑對發光強度的影響 TCPO在水相環境中溶解度較小，且實驗表明當有水存在時，化學發光強度會降低。對幾種有機溶劑（如乙腈、乙醇、丙酮、四氫呋喃、正丁醇、叔丁醇、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯、乙酸乙酯等）的考察表明，以90％（V／V）乙腈為溶劑，可獲得最大發光信噪比和最佳的重現性。

3.2.2 TCPO，H2O2和咪唑的濃度對化學發光強度的影響 在乙腈介質中，咪唑對TCPO化學發光體系有很強的增強作用（圖4），考察了TCPO，H2O2和咪唑的濃度分別在0.5～5.0 mmol/L，0.05～1.0 mol/L和0.1～50 mmol/L范圍時，其濃度對化學發光強度的影響。結果表明，當TCPO，H2O2和咪唑的濃度分別為5.0×10－3， 0.5和1.0×10－3 mol/L時，可以獲得最大的發光強度信噪比。

圖4 咪唑濃度對發光強度的影響

Fig．4 Effect of Glyoxaline concentration on CL intensity

3.3 標準曲線

在最佳實驗條件下，CEA含量在1.0～80 SymbolmA@ g/L范圍內具有線性關系，ΔI＝6.4331c＋28774（r＝0.9989）; 檢出限為0.3 SymbolmA@ g/L（3σ）。對20 SymbolmA@ g/L CEA平行測定11次，相對標準偏差（RSD）為39％。與ELISA法和魯米諾化學發光免疫法相比，此方法具有更高的靈敏度（ELISA法和魯米諾化學發光免疫法的檢出限分別為1.7和0.5 SymbolmA@ g/L）。

3.4 樣品分析和回收實驗

分別用ELISA法和本方法對人血清樣品（采自陜西師范大學醫院）中CEA含量進行測定，并用本方法進行回收實驗，結果見表1， 結果令人滿意。

表1 樣品回收率實驗結果

Table 1 Results of recovery test of carcinoembryonic antigen（CEA） in human scrum samples

樣品

SampleCEA （SymbolmA@ g/L）ELISA法

ELISA method本方法

Present method加入濃度

Added（SymbolmA@ g/L）測得濃度

Found（SymbolmA@ g/L）回收率

Recovery

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Chemiluminescent Analysis of Carcinoembryonic

Antigen in Serum Samples

XUE Pan， ZHANG Zhu-Jun*， ZHANG Xiao-Ming

（School of Chemistry and Material Science， Shaanxi Normal University，

Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science of Shaanxi Province， Xi′an710062）

Abstract Based on the catalyzed oxidation of horseradish peroxidase （HRP） to the hydrogen peroxide and 3-（4-hydroxyphenyl propionate） （PHPPA） reaction， the fluorescent product， 3-（4-hydroxyphenyl propionate） dimer， can react with bis（2，4，6-trichlorophenyl）oxalate（TCPO） and hydrogen peroxide to enhance chemical luminescence by the participation of imidazole enhancer in acetonitrile medium. With horseradish peroxidase（HRP） labeled Carcinoembryonic Antigen（CEA） monoclonal antibody， by “sandwich type” CEA immune response， a simple， sensitive， and rapid chemiluminescence immunoassay method for the determination of Carcinoembryonic Antigen （CEA） in human serum samples has been developed. There was a very good linear correlation between response and amount of CEA in the range of 1.0－80.0 SymbolmA@ g/L （r＝0.9989）. The detection limit was 0.3 SymbolmA@ g/L （S/N＝3）. The relative standard deviation （n＝11） was 3.9%. The proposed method has been used for the determination of CEA in human serum.

Keywords Carcinoembryonic antigen; Horseradish peroxidase-catalyzed fluorescent reaction; Chemiluminescence immunoassay

（Received 21 June 2010; accepted 15 August 2010）