血培養陽性標本直接細菌鑒定和藥敏中應用分離膠試管的方法探討

陳歡歡,文 怡,劉根焰,顧 兵,梅亞寧,陳友華

(南京醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科,江蘇南京,210029)

臨床上菌血癥和敗血癥是嚴重危及患者生命的疾病,死亡率高達29%,因此快速診斷是控制感染、降低死亡率的關鍵。臨床使用全自動血培養儀,提高了血培養的陽性率,也縮短了培養時間[1-2],但按常規法鑒定出細菌和藥敏試驗仍需要2～3 d。作者在對全自動血培養儀培養陽性的標本,直接吸取一定量血液,注入帶分離膠試管中,離心后取上層液體直接用API鑒定試條鑒定細菌并進行藥敏試驗,同時與培養轉種得到純菌后常規方法鑒定和藥敏試驗結果比較,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年3月～2010年7月本院門診及住院患者血培養陽性標本66例。

1.2 儀器與試劑

全自動血培養儀BACTEC 9120,美國O rganon2Tekn ika公司產品;API鑒定試條,法國BioM erieux公司產品;LD-2A離心機 北京醫用離心機廠;哥倫比亞血瓊脂基礎、MH瓊脂。藥敏紙片:頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、萬古霉素、亞胺培南、頭孢西丁、環丙沙星、丁胺卡那霉素、紅霉素、克拉霉素、頭孢他啶/克拉維酸、氨芐西林、復方新諾明均為英國Oxoid產品。質控菌株大腸埃希菌(ATCC 25922),金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)。

1.3 方法

陽性標本離心集菌處理及快速檢測:血培養儀培養陽性報警后,從陽性瓶中無菌抽取培養液約3 mL,注入帶分離膠的試管中,置離心機2 000 rpm離心15 min后,吸取分離膠上層液,并輕輕混勻,直接涂片行革蘭染色,根據染色結果,并通過觸酶或氧化酶試驗對細菌初步分群后,選擇相應API鑒定試條進行細菌鑒定,再將離心上層液制備成0.5 M cFarLand菌懸液,直接用瓊脂擴散法進行藥物敏感試驗,量取抑菌圈直徑。

陽性標本的常規檢測:血培養儀培養陽性報警后,從陽性瓶中無菌抽取培養液轉種血平板、巧克力平板,經35℃培養18～24 h形成菌落后,取菌落涂片行革蘭染色,根據染色結果,并通過觸酶或氧化酶試驗對細菌初步分群后,選擇相API鑒定試條進行細菌鑒定,用K-B法進行藥物敏感試驗,量取抑菌圈直徑,結果進行比較。

2 結 果

66例血培養陽性標本離心集菌處理后直接檢測與轉種獲取菌落檢測結果符合率:腸桿菌科22株,符合率100%;非發酵菌群10株,符合率85%;葡萄球菌屬28株,符合率90%;腸球菌屬6株,符合率92%。

血培養陽性標本離心集菌處理后與轉種獲取菌落藥敏試驗結果符合率見表1。

3 討 論

如何對血培養陽性標本進行快速準確的菌種鑒定和藥物敏感試驗,始終困擾著臨床微生物工作者。國內外臨床微生物工作者,Ken、Marjan和T homas做了很多快速藥敏的嘗試,均也采用離心法對血培養陽性培養液進行處理后進行了直接上機MIC藥敏[3-5],國內朱德全、文元和汪定成等報道類似的實驗[6-7],曾有文獻報道,直接用陽性標本作細菌鑒定和藥物敏感試驗,方便、快速。但由于血培養標本中血細胞等有型成分的存在,常影響直接取培養液涂片的革蘭染色效果及判定。本研究采用含分離膠的試管處理陽性標本集菌后檢測,經一定時間離心分層,可較為準確的得到無血細胞的菌懸液,以保證獲得足夠量的菌懸液。吸取菌懸液直接涂片后行革蘭染色結果判定更直觀,菌懸液亦可直接用于細菌鑒定和藥物敏感試驗,平均可提前一天報告陽性結果。

本研究的66株血培養陽性標本離心集菌處理及檢測與常規檢測結果表明:離心集菌處理后直接鑒定與常規檢測兩種方法對細菌菌種鑒定差異不大,符合率均大于85%。2種方法的藥物敏感試驗結果也相差不大,符合率均大于95.2%,結果比較滿意,與國外Doren等報道96.8%相接近[8]。而葡萄球菌鑒定符合率高于國內一些報道[9]。

血清分離膠主要由硅膠,大分子碳氫化合物,疏水膠等組成。是具有觸變性的粘性膠體,呈惰性,氣密性好,比重 1.045～1.050,血球比重 1.060～1.080,血漿比重1.025～1.030。分離膠正好在血球與血漿之間。離心后,分離膠將兩者分離開。血培養陽性標本在試管中經2 000 r/min,離心15 min,可以將其分成4層(從上至下):血漿層,細菌層,分離膠層,血球層。吸取分離膠層之上的細菌層,直接涂片染色,完全排除了血球對革蘭染色結果判定的影響,涂片背景非常清晰,菌體易辨。血培養陽性標本溶液經離心后,細菌相對集中,制成一定菌量的懸液后可直接加到鑒定試條上。

本研究最大優點利用分離血培養陽性的培養液直接鑒定細菌,比常規方法轉種平板后鑒定所需時間至少要縮短1～2 d。但仍有一些問題需要探討,如本研究的菌種類別尚少,缺少真菌檢出的報道;每次吸取陽性血培養瓶中的培養液中的菌量不同,對藥敏試驗結果是否影響;陽性瓶中如含有兩種以上菌株,用離心集菌處理后直接鑒定就有一定困難。這都有待于今后進一步研究和探討。

[1] 程彥國,張軍民,趙莉莉,等.全自動培養儀的臨床應用及評價[J].中華醫學檢驗雜志,1999,22:74.

[2] 蔣燕群,衛 國,倪語星.應用全自動血培養儀提高血液、無菌體液培養的陽性率[J].中華醫學檢驗雜志,1999,22:71.

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[6] 朱德全,季海生.血培養陽性標本直接細菌鑒定和藥敏的探討[J].中華醫院感染學雜志,2005,15:1300.

[7] 文 元.葡萄球菌敗血癥快速準確鑒定及藥敏試驗探討[J].海南醫學,2006,16:134.

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[9] 吳秋梅,葉曉卉,崔嫻維,等.Bact/ALERT檢測陽性的血培養標本直接用Vitek進行細菌鑒定的方法探討[J].中華醫院感染學雜志,2000,10(1):771.