消化道惡性腫瘤化療藥物相關基因檢測臨床應用價值

姚家奎,王曉鈴,柏斗勝,孫長江

(揚州大學臨床醫學院,江蘇揚州,225001)

消化道惡性腫瘤是我國腫瘤患者死亡的主要原因之一,嚴重危害人民健康,其主要治療手段是外科手術,但大多數患者就診時已屬中晚期,化療和放療技術的發展提高了腫瘤外科根治切除術后的療效,又為不能實施手術切除患者提供了一個新的治療途徑。目前盡管腫瘤化療取得了一些進展,但由于在不同種族人群中,不同個體間仍有顯著的化療有效率、毒性反應的異質性。據有關統計數據,目前應用的抗腫瘤藥物對至少70%的患者療效有限,20～40%患者甚至有可能接受了錯誤的藥物治療;據美國癌癥協會估計,90%以上的患者死于不同程度的腫瘤細胞耐藥性,因此逆轉腫瘤細胞的耐藥性,提高化療藥物的敏感性對癌癥的治療具有積極意義[1]。隨著藥物基因組學以及在此基礎上發展的蛋白組學、轉錄組學等高通蛋白和超高通技術的出現,使臨床醫師和分子生物學家很快就找到了共同的關注點,即從個體基因組中分析和鑒定患者之間存在的疾病相關的個體差異,并利用這些差異來合理地篩選藥物指導臨床治療。本文就消化道腫瘤患者化療藥物基因組學基因型進行了分析,以便對選擇化療藥物個性化治療進行指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例選擇2007年1月～2010年10月在本院住院就診患者共35例,其中胃癌15例;腸癌6例;食道癌4例;胰腺癌6例;膽管癌2例;膽囊癌2例。男性19例,女性 16例;最大年齡 70歲,最小年齡45歲,平均59歲。所有手術后標本均經病理學檢查確診。

1.2 試劑與TaqMan等位基因檢測及分型方法

所有患者化療前抽取血液標本2.0 mL注入EDTA抗凝管,充分混勻后待測相關基因型。應用血液基因組DNA快速抽提純化試劑盒(Promega,USA)提取基因組DNA,基因分型采用美國應用生物系統公司(ABI)生產的SNP基因分型試劑盒及TaqMan PCR混合試劑盒。PCR反應 體 系 為 25 μ L,包 括:TaqMan UniversaL PCR Master Mix(AppLied Biosystems,Foster City,CA,USA)12.5 μ L,20 ×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 1.25 μ L,25 μ g/mL 的基因組 DNA 2 μ L,超 純 水 9.25 μ L。 在ABI7000PCR儀擴增:95℃10 min激活Mix里的金牌DNA擴增酶;繼而92℃15 s變性,60℃1 min退火及延伸,共40個循環。ABI3130DNA測序儀分析SNP分型結果。為保證基因分型的準確性,所有檢測標本均由另一操作者進行重復實驗,結果與第1次完全一致。

2 結 果

基因分型及突變類型35例消化道惡性腫瘤患者檢測結果:T/T基因型11例(11/35);G/A基因型5例(5/35);A/A基因型8例(8/35);I/V基因型3例(3/35);V/V基因型4例(4/35);R/R基因型4例(4/35)。

3 討 論

隨著人類基因組計劃的完成以及對腫瘤化療藥物應用研究的發展,人們逐漸認識到個體基因的差異,最為常見的差異就是單核苷酸多態性(SNP)。發現一些藥物的毒副作用和這些位點緊密相關,其主要機理是若干位點的變化使藥物代謝基因的活性下降,有些則直接造成該基因活性的喪失,從而使藥物代謝產生障礙引起一系列嚴重的化療毒副作用。因此,如果能對這些基因位點進行檢測,預測藥物是否將對病人產生不良作用,實現化療藥物的針對性、個體化用藥,就能從根本上緩解病人痛苦,提高病人在化療過程中的生存概率。所以,腫瘤治療的個性化越來越受到醫學界的重視,臨床開展治療前基因型篩選更具有重要意義。

5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的類似物在人體內代謝成5-氟去氧尿嘧啶(F-dump)后,與胸腺嘧啶合成酶(TS)形成穩定化合物,抑制TS功能,由于該酶負責細胞內的去氧單磷酸尿苷(dUMP)轉化成去氧單磷酸腺苷(dTMP),一旦它的功能被抑制,將細胞內的唯一dTMP合成途徑被截斷,導致其含量不足,影響細胞復制DNA的合成,進而將細胞生長抑制在細胞周期中的DNA合成前期(即G1期、S期之間),以達到殺死癌細胞的目標。通過MTHFR(C677T)多態性基因檢測,預測5-FU治療的療效,T/T等位基因較其他基因型要敏感,療效好;與腫瘤化療藥物代謝相關的二氫嘧啶脫氫酶(DPD),是另一種主要參與嘧啶分解代謝的酶,DPD是常用化療藥物5-FU以及口服嘧啶類化療藥物的代謝限速酶,其活性在人群中存在個體差異,進入體內的5-FU80%是經由DPD代謝清除,在5-FU分解代謝中起關鍵作用。該酶失活影響5-FU這種藥物的分解代謝,造成治療過程中有毒藥物在體內的積累,引起嚴重的毒副反應。該基因突變型的癌癥患者接受5-氟尿嘧啶治療即會產生強烈的毒副作用甚至死亡。許多研究表明臨床上可以見到DPD酶活性部分或完全缺乏的患者接受5-FU化療后療效明顯,但出現嚴重毒副作用,DPD酶活性受DPD酶基因(DPYD)多態性的影響,而基因多態性>90%的表現形式為單核苷酸多態性(SNP)[2]。SaLgueiro等[3]的研究表明,DPYD基因14外顯子的突變與相當部分5-FU相關嚴重毒副反應的發生有關。為提高這類藥物的療效同時預防和減少其毒副反應,更好地實現5-FU及嘧啶類藥物的個體化治療.通過DPD＊2A多態性基因檢測,預測對患者毒副作用,G/G型不增加毒副作用,G/A及A/A增加患者發生不良反應的危險性。DPYD的SNP檢測具有重要的臨床意義。據有關研究報道使用5-FU治療而發生毒性副作用的腸癌患者中約有17%～57%帶有DPD＊2A基因型,可見此SNP影響了DPD活性表現,DPD活性高低直接決定了5-FU進入合成代謝和產生核苷酸類似物的量,藥代動力學研究也顯示DPD活性缺乏可導致5-FU體內清除受阻,半衰期顯著延長,分解減弱而合成增加,細胞毒性也相應增強。因此若能在5-FU治療前先行檢測患者是否帶有DPD＊2A,將可以預測5-FU治療的副作用,若是檢測發現患者帶有此SNP,則可避免使用5-FU治療,若無法避免則應于患者接受治療后密切追蹤其治療反應。作者還通過MTHFR(C677T)多態性基因檢測了解MTX(甲氨喋呤)毒副作用,T/T等位基因較其他基因型毒副作用增加。

GSTs(谷胱甘肽轉移S酶類)為人體內最重要的Ⅱ相代謝酶,它是一組超基因家族蛋白,現已發現有 4種類 型:α(GSTA)、π(GSTP)、μ(GSTM)、θ(GSTT),其主要分布于消化、呼吸道等處上皮。該酶的作用主要催化還原谷胱甘肽與許多具有遺傳毒性的復合物結合,增加水溶性,利于毒物從尿和膽汁排泄,在多數情況下是一種解毒過程;具有間接誘導DNA修復,維持細胞基因組完整性的作用,是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統。研究發現GSTs過度表達與腫瘤耐藥相關,特別是與鉑類藥物的耐藥性關系密切[1]。GSTs基因多態性不僅與肺癌、腸癌等腫瘤遺傳易感性有關,其活性變化還與惡性腫瘤對化療藥物的敏感性相關,導致GST活性下降的遺傳變異會增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[4-6]。GSTP1是GST家族的主要成員,它在肝臟組織中有較高表達,其基因多態已被證實可導致GSTP1酶活性顯著降低;當導入外源性GSTP1基因或在誘導癌細胞耐藥過程中細胞表達GSTP1時,細胞內的化療藥物特別是鉑類藥物的貯留量則明顯減少。所以,認為GSTP1可能是抗藥性的標志之一,與腫瘤細胞對抗癌藥耐受性的獲得有關。STOEHLMACHER等[7]研究結果證實,GSTP1 ILe105VaL基因多態性可能與晚期結直腸癌病人對鉑類化療藥物療效相關。通過檢測GSTM1多態性,缺失型的較其他基因型要敏感,療效好;GSTP1(I105V)基因,I/V,V/V等位基因較其他基因型要敏感,療效好。本實驗應用TaqMan-MGB探針等位基因分型技術檢測GSTP1基因I105V的多態性,分析消化道惡性腫瘤病人基因多態性與應用鉑類為基礎的藥物化療后療效的關系,可用于指導該類藥物的個體化使用,提高臨床治療的針對性和可預見性。

XRCC1(X線交錯互補修復基因1)是一種與DNA單鏈損害堿基切除修復直接相關的蛋白質,其至少包括3種常見的遺傳多態性,其中Arg399※GLn變異在腸癌中最為常見,其發生與DNA損害標志物水平上升有關。作者通過XRCC1(R399Q)多態性檢測到4例R/R等位基因。對于患者化療藥物療效,R/R等位基因較其他基因型(R/Q、Q/Q)敏感、療效好。近年來國內相關研究顯示,胃癌患者XRCC1多態性與療效有關[8]。國外研究表明XRCC1基因的多態性可預測鉑類化療藥物治療轉移性腸癌療效,StoehLmacher等[9]研究了61例接受奧沙利鉑聯合5-FU治療的轉移性腸癌患者XRCC1基因密碼子399多態性位點進行基因分型。研究發現了位于10號外顯子的R399Q的多態性,在11例有效的病例中,有8例(73%)是RR基因型,3例(27%)是雜合子(RQ);在 10例進展的病例中,3例(30%)是QQ變異基因型而5例(50%)是雜合子;穩定的病例中,15例(38%)是R等位基因的純合子,23例(58%)是雜合子,2例(4%)是Q等位基因的純合子。

總之,由于藥物在體內敏感性影響因素復雜,目前腫瘤患者化療藥物基因型測定研究的真正目的可能不在于篩選哪些藥物在體內應用時更為敏感,而在于篩選體內應用時可能不敏感的藥物,以避免盲目化療可能導致的毒性反應。所以化療前及化療過程中動態檢測藥物敏感性和抗藥性,是實現化療個體化和提高療效的重要基礎,合理選擇化療藥物,可有效延長癌癥患者生存期和避免患者不必要的身體和經濟上的負擔。

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