穿心蓮對(duì)血管成形術(shù)后家兔血小板促血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

何浩，汪道文

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥230001;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)后再狹窄一直是其主要的并發(fā)癥而影響其遠(yuǎn)期療效。盡管藥物洗脫支架(DES)明顯改善了其近期療效，但由于冠脈狹窄的原因及機(jī)制較為復(fù)雜，因而有關(guān)PCI的很多問(wèn)題仍懸而未決。其多數(shù)學(xué)者認(rèn)為［1］，PCI直接導(dǎo)致血管組織損傷，血小板粘附和激活，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移和增生而導(dǎo)致管腔狹窄，這是其最主要機(jī)制，血小板和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)在再狹窄發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。本文著重探討中藥穿心蓮對(duì)血管成形術(shù)后血小板促血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)脈粥樣硬化(AS)動(dòng)物模型和腔內(nèi)血管成形術(shù)(TA) 選正常3～4周齡日本大耳白兔10只(由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，每日每只兔給飼含膽固醇0.5g、豬油1.0 g的標(biāo)準(zhǔn)混合飼料。1周后打開(kāi)家兔腹腔，暴露其腹主動(dòng)脈，用無(wú)齒鑷輕夾動(dòng)脈3次，通過(guò)擠壓和摩擦作用損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，長(zhǎng)度3 cm。術(shù)后關(guān)閉腹腔，繼續(xù)給高脂飼料。4周后以76%泛影葡胺進(jìn)行血管造影。血管造影見(jiàn)狹窄后，對(duì)狹窄段血管進(jìn)行TA術(shù)，共6只。選直徑3.0 mm的Gruentzig球囊導(dǎo)管，在導(dǎo)絲引導(dǎo)下以4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓進(jìn)行充液擴(kuò)張，連續(xù)3次，每次持續(xù)30 s，直至狹窄段被充分?jǐn)U開(kāi)。

1.2 VSMC培養(yǎng) 分別取正常段、AS狹窄段及TA后40 h的擴(kuò)張段腹主動(dòng)脈中膜組織進(jìn)行VSMCs培養(yǎng)，原代細(xì)胞培養(yǎng)采用組織貼塊法，培養(yǎng)液為含100 ml/L胎牛血清(美國(guó) Gibco Lab)的 Eagle培養(yǎng)基(日本制藥株式會(huì)社)，用5%碳酸氫鈉將培養(yǎng)液PH值調(diào)至7.0。置于含5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2周后細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁，用0.1%胰蛋白酶化融合的細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。選其3～4代生良好的細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) 用0.1%胰蛋白酶消化上述各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度制成3×108/L后，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。正常、AS狹窄段及TA后3組VSMCs各分成3個(gè)亞組，分別向3個(gè)亞組培養(yǎng)孔中加人:(1)穿心蓮(為二次提取物，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院贈(zèng)，終濃度100 mg/L);(2)血小板(2.0×108/L ，以二磷酸腺苷(ADP)誘聚激活，誘聚濃度3μmol/L);(3)穿心蓮+血小板(終濃度同前，旨在用穿心蓮對(duì)血小板進(jìn)行預(yù)處理;(4)ADP(終濃度3μmol/L);(5)細(xì)胞培養(yǎng)液(對(duì)照組)，以觀察不同刺激物對(duì)VSMCs生長(zhǎng)的影響。另對(duì)擴(kuò)張前的AS段細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入等量培養(yǎng)液，與TA－VSMCs對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察兩者生長(zhǎng)速度的快慢。每個(gè)亞組在培養(yǎng)板上設(shè)4～6孔，每孔總體積1.3 ml，再培養(yǎng)36 h后終止試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)3次。最后在光鏡下直接進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 125碘一尿嘧啶脫氧核苷(125I—UdR)參入另將各組細(xì)胞濃度制成3×108/L，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液1 ml，培養(yǎng)24 h后開(kāi)始分組實(shí)驗(yàn)，具體分組方法同細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)分組。加入刺激物和培養(yǎng)液后再加入標(biāo)記物125I－UdR，每孔1微居里(μCi)，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后終止實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。以微孔濾膜(孔徑0.45μm)分離VSMCs，將濾膜置于試管中，以γ閃爍計(jì)數(shù)器(FJ 2017)測(cè)定每管的放射性強(qiáng)度，以每分鐘的放射計(jì)數(shù)率(cpm)大小來(lái)反映VSMCs內(nèi)DNA的合成量多少。

2 結(jié)果

2.1 AS狹窄段和TA后40 h的VSMCs增殖的變化 TA后40 h的VSMCs組細(xì)胞計(jì)數(shù)和放射計(jì)數(shù)率均較術(shù)前AS狹窄段VSMCs組有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 AS狹窄段及TA后VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)及放射計(jì)數(shù)率

2.2 激話的血小板對(duì)TA前后VSMCs增殖的直接作用 如表l所示，AS狹窄段VSMCs組在加入血小板懸液培養(yǎng)后，與同種細(xì)胞對(duì)照組相比，其細(xì)胞計(jì)數(shù)及放射計(jì)數(shù)率均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而加人血小板誘聚劑ADP培養(yǎng)的VSMCs組與為穿心蓮處理的VSMCs組比較，其細(xì)胞計(jì)數(shù)和放射計(jì)數(shù)率均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

Clowes等［2］早期就有發(fā)現(xiàn)，用球囊剝脫動(dòng)脈內(nèi)皮后，VSMCs增殖在2～3 d達(dá)到高峰。本研究結(jié)果顯示，TA后40 h較TA前AS狹窄段的VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)及放射計(jì)數(shù)率雖有所增加(約22%左右)，但無(wú)顯著性差別，這正說(shuō)明TA后40 h的VSMCs繁殖可能有加快趨勢(shì)但此時(shí)的VSMCs尚未達(dá)到增殖高峰。這可能是部分VSMCs已開(kāi)始增殖，而另一部分則處于增殖前或靜止期狀態(tài)。

Friedman等［3］對(duì)血小板減少的家兔內(nèi)皮進(jìn)行球囊剝脫損傷，結(jié)果這些家兔的動(dòng)脈損傷段的內(nèi)膜增厚明顯不如血小板計(jì)數(shù)正常的對(duì)照組家兔。這一研究間接證明了血小板對(duì)內(nèi)膜增生的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，激活的血小板對(duì)TA前后的VSMCs增殖具直接的作用。加入血小板的VSMCs組較自身對(duì)照紐的細(xì)胞計(jì)數(shù)和放射計(jì)數(shù)率均明顯增加。而血小板誘聚劑ADP對(duì)VSMCs增殖則沒(méi)有影響。這說(shuō)明血小板對(duì)VSMCs的作用歸因于血小板釋放的其他活性物質(zhì)，如生長(zhǎng)因子。無(wú)齒鑷鉗夾擠傷和TA術(shù)球囊撕裂損傷內(nèi)膜，使內(nèi)皮下膠原纖維和彈力纖維暴露，血小板在局部粘附聚集并釋放出包括血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)等在內(nèi)的一些活性物質(zhì)，刺激VSMCs增生。VSMCs增殖是一種組織損傷后的修復(fù)反應(yīng)［1］，但過(guò)度增生則使內(nèi)膜增厚而形成管腔的再狹窄。

有報(bào)道，發(fā)現(xiàn)穿心蓮(APN)提取物能明顯抑制ADP和腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)［4］，并可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生［5］。API預(yù)防用藥能夠顯著減少主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊面積［6］，從而減少動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄的發(fā)生率［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，加入穿心蓮對(duì)血小板進(jìn)行預(yù)處理后，改組細(xì)胞計(jì)數(shù)和放射計(jì)數(shù)率均較未加血小板處理的血小板組明顯減少，說(shuō)明穿心蓮能抑制血小板活性物質(zhì)所致的VSMCs的增生，提示穿心蓮對(duì)PCI后血小板促VSMCs增生等組織修復(fù)反應(yīng)導(dǎo)致的血管再狹窄可能是值得進(jìn)一步研究的藥物。關(guān)于其機(jī)制，尚不十分清楚，可能是與穿心蓮使血小板內(nèi)使前列環(huán)素(PGI2)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量增多，纖溶酶原激活物抑制物(PAI)活性降低有關(guān)［5］，升高的cAMP可以抑制血小板的活性［8］。

［1］ 高志國(guó)，黃鶴，陳宏才，等.經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)后再狹窄機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)進(jìn)修雜志，2000，28(108):76-79.

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