血必凈對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠肺組織高遷移率族蛋白1表達的影響

張之齡，尹小燕，童小文，朱健

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院急診科，上海200011)

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥之一，為嚴重感染引起的不可控制的全身性炎性反應，可迅速發展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)。肺臟是這一連貫病理過程中最早也最易受累的靶器官，臨床表現為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征［1］(ALI/ARDS)。雖然ALI的具體發病機制仍不明確，但研究［2］發現高遷移率族蛋白 1(HMGB1)可能作為新的“晚期”炎癥因子參與了內毒素的致病過程，對ALI/ARDS的發生和發展起重要作用。本實驗在建立大鼠LPS誘導膿毒癥肺損傷模型的基礎上，觀察肺組織HMGB1的表達，并采用血必凈干預，研究其對大鼠膿毒癥肺損傷的保護作用，探討可能的作用機制，為防治膿毒癥肺損傷開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠45只，2.5～3.5 月齡，體質量 250 ～280 g/只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供［生產許可證號:SCXK(滬)2008-0016］。

1.2 實驗藥品和試劑 脂多糖(LPS，Escherichia coliO127:B8，L3129，Sigma，美國);HMGB1 羊抗多克隆抗體(Santa Cruz，美國);血必凈注射液(規格10ml/支，天津紅日藥業有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組、模型建立及給藥方法 以10%水合氯醛5m l/kg腹腔注射將大鼠麻醉后固定，經大鼠股靜脈按5 mg/kg注射LPS。45只SPF級雄性成年Wistar大鼠隨機分為三組:(1)健康對照組(n=15)、(2)脂多糖組(LPS 組，n=15)、血必凈干預組(XBJ組，n=15)。血必凈組在造模前半小時靜脈內給予血必凈4ml/kg，健康對照組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各隨機處死大鼠5只，分別作為I、Ⅱ、Ⅲ亞組，無菌留取大鼠肺組織。

1.3.2 標本制備 在造模后6 h、12 h、24 h各隨機處死大鼠5只，分別作為I、II、Ⅲ亞組，取右肺上、下葉組織用4%多聚甲醛固定，制成病理切片，分別采用蘇木精-伊紅(H-E)染色及免疫組織化學染色。

1.3.3 免疫組織化學法(IHC)檢測肺組織中HMGB1蛋白表達 肺組織中HMGB1蛋白的檢測采用SP法。石蠟包埋肺組織作5μm厚度的切片常規脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，0.3%H2O2甲醇溶液消除內源性過氧化物酶，胰蛋白酶修復后，正常羊血清封閉非特異性抗原，滴加1∶50的羊抗大鼠HMGB1多克隆抗體，2℃過夜。PBS漂洗后滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗后二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。以Image pro Plus5.1圖像分析軟件對肺組織免疫組織化學結果進行半定量分析，每張切片隨機選5個不重復的視野，放大400倍，計算機自動測定并計算HMGB1陽性染色的積分光密度值(IOD)，分別取其平均值進行分析。

1.4 統計學處理 采用SPSSl3.0軟件包分析，所有數據均采用均數±標準差(±s)表示，多組均數采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。

2 結果

2.1 肺組織的病理形態學變化 光鏡下，健康對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡隔無水腫、無炎癥，肺泡腔清晰。且各時間點無明顯差異;LPS組大鼠肺組織結構基本消失，肺泡隔增寬，部分肺泡內見滲出、水腫、出血，肺間質見大量炎癥細胞浸潤。且隨時間點增長而明顯。XBJ組大鼠肺組織肺泡隔略有增寬，部分肺泡內見滲出、水腫、出血，肺間質見少量炎癥細胞浸潤。

2.2 肺組織HMGB1蛋白的表達 正常大鼠肺組織微弱陽性表達HMGB1，少量分布于肺泡和間質上皮細胞、小支氣管黏膜上皮細胞。LPS組肺組織HMGB1強陽性表達，主要分布于肺泡上皮和間質上皮細胞、小支氣管黏膜上皮細胞、肺泡和間質中大量的炎性細胞。XBJ組肺組織HMGB1陽性表達減輕。圖像分析軟件測定的積分光密度值提示，LPS各亞組較健康對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，XBJ各亞組較LPS組比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，見表1。

3 討論

既往認為，早期促炎介質(包括 TNF-α、IL-1等)是引起肺損傷時機體失控性炎性反應與組織損害的關鍵介質，然而過去十余年中，臨床采取TNF-α和IL-1拮抗劑治療并未取得滿意效果，提示可能存在晚期炎癥介質參與病理反應。近年研究表明，HMGB1是一種關鍵的晚期促炎介質，在ALI/ARDS病程進展中發揮重要作用，使人們看到了肺損傷治療的新希望。HMGB1是一種核內蛋白，最早被認為是基因轉錄中一種重要的因子［3］。1999年，Wang等［2］首次報道HMGBl作為新的潛在的晚期炎癥介質，參與了膿毒癥的發病過程，是內毒素致死效應的晚期重要炎癥介質。HMGBl的致病作用的另一大特點是有維持和放大炎癥作用。感染因素或非感染因素均可引起細胞主動或被動釋放HMGB1［4］。通過晚期糖基化終末產物受體及TLR 4，2結合，HMGB1將信號傳入細胞外環境。同時，研究發現，HMGB1可分泌到胞漿乃至胞外，與 IL-l、IL-6、TNF-α等重要炎癥因子相互誘生并可引起炎癥信號分子NF-κB的核移位。應用抗HMGB1抗體進行干預后，對嚴重內毒素血癥、膿毒癥、關節炎以及內毒素誘導的急性肺損傷均有積極的治療作用。這些觀察表明HMGB1是細胞損傷的關鍵介質，因此抑制它可以改善臨床結果。

表1 三組大鼠不同時間點肺組織HMGB1的免疫組織化學表達(IOD±s，×103)

表1 三組大鼠不同時間點肺組織HMGB1的免疫組織化學表達(IOD±s，×103)

注:I、Ⅱ、Ⅲ亞組為6h、12h、24h各隨機處死大鼠5只所檢測結果;與對照組同時間點比較，a P＜0.05;與LPS組同時間點比較，b P ＜0.05

組別 鼠數(只) Ⅰ亞組(6h，n=5) Ⅱ亞組(12h，n=5) Ⅲ亞組(24h，n=5)對照組15 4.68 ±1.26 4.89 ±1.37 4.97 ±1.12 LPS 組 15 15.46 ±3.69a 27.21 ±4.35a 43.24 ±5.39a XBJ組 15 10.76 ±2.32ab 19.44 ±3.68ab 28.60 ±5.13ab

本實驗采用大鼠股靜脈注射LPS復制膿毒癥肺損傷大鼠模型。免疫組織化學的研究結果顯示，正常大鼠肺組織呈微弱陽性表達HMGB1，少量分布于肺泡和間質上皮細胞、小支氣管黏膜上皮細胞，各時間點未見明顯區別。LPS組肺組織HMGB1強陽性表達，主要分布于肺泡上皮和間質上皮細胞、小支氣管黏膜上皮細胞，肺泡和間質中大量的炎性細胞，呈棕黃色染色。12h時間點可見較強陽性表達，且以24h為最強。Kim等［5］在失血性休克引起的肺損傷動物模型中也有同樣的發現。同時我們在光鏡下觀察到肺泡隔增寬，部分肺泡內見滲出、水腫、出血，肺間質見多量炎癥細胞浸潤等明顯肺損傷表現，本實驗肺組織HMGB1表達與肺組織的病理損害程度基本一致。這些均證實肺組織HMGB1誘生與內毒素介導的急性肺損害關系密切。

以往的研究還表明HMGB1在損傷后相對晚期階段表達，這一發現與我們的觀察結果亦一致，即在LPS加入后12h肺組織HMGB1的水平明顯增加。因此提示HMGB1在LPS誘導的肺損傷炎癥及發展的過程中起著關鍵作用。

隨著對ALI發生機制研究的逐步深入，尋找能減少早期和晚期炎性介質分泌的藥物日益引起人們的關注。血必凈是在古方血府逐瘀湯基礎上精煉出的復方中藥靜脈制劑，由中藥赤芍、川芎、丹參、紅花、當歸的提取物組成，具有很好活血化瘀、疏通絡脈、潰散毒邪的作用。

本研究結果顯示，應用血必凈治療后各時間點肺組織HMGB1蛋白表達均顯著降低，同時肺組織病理形態學改變均有明顯改善，提示血必凈可有效降低肺組織HMGB1的表達，減少炎癥因子的釋放和炎性反應的擴大，減輕肺組織炎性反應，對膿毒癥誘導的肺損傷具有一定治療作用。

目前針對于血必凈抗炎機制的多項基礎研究尚處于初級階段，許多問題還需進行深入研究，其是否能夠作為危重病治療藥物有待進一步評價。從本實驗結果證實ALI的發病過程中可能出現了晚期炎癥因子HMGB1表達的上調，運用血必凈治療膿毒癥ALI后能夠抑制大鼠肺組織HMGB1的表達水平，改善ALI時的炎性反應，減少白細胞滲出，減輕肺水腫及肺組織病理損傷，對大鼠膿毒癥肺損傷有明顯保護作用，預示著血必凈具有良好的臨床應用前景，可能會給膿毒癥的治療帶來希望。

［1］ Julie A，Lorraine B，Gordon R.The role of the coagulation cascade in the continuum of sepsis and acute lung injury and acute respiratory distress syndrome［J］.Semin Respir Crit Care Med，2006，27(4):365-376.

［2］ Wang H，Bloom O，Zhang M，etal.HMG-1 as a latemediator of endotoxin lethality in mice［J］.Science，1999，285(5425):248-251.

［3］ Bustin M.Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins［J］.Mol Cell Biol，1999，19(8):5237-5246.

［4］ Fang WH，Yao YM，Shi ZG，et a1.The significance of changes in high mobility group-1 protein mRNA expression in rats after thermal injury［J］.Shock，2002，17(4):329-333.

［5］ Kim JY，Park JS，Strassheim D，et al.HMGB1 contributes to the development of acute lung injury after hemorrhage［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005 ，288(5):958-965.