低值魚肉蛋白酶解工藝研究

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州434025）

近年來，我國水產(chǎn)生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，已成為世界第一漁業(yè)大國。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴張，產(chǎn)量大幅度提高，水產(chǎn)品加工的地位已顯得日益重要。隨著人們生活水平的提高，低值魚類直接食用的價值越來越低[1]。目前，低值魚深加工仍是個薄弱環(huán)節(jié)。除冷凍外運外，精加工尚處于起步待開發(fā)階段[2-3]。對低值魚蛋白進行水解得到的水解蛋白，含有大量的肽類和氨基酸，不僅具有獨特的風味，而且還有許多生理活性，在調(diào)味品和營養(yǎng)保健等方面都有很廣泛的應用[4-5]。本研究以翹嘴紅鲌(Hemiculterlcucisculus）為對象，探討了魚肉酶解工藝，試圖為低值魚的深加工探索一條出路。

1 材料與方法

1．1 材料

翹嘴紅鲌采購于長江大學農(nóng)貿(mào)市場。測定小翹嘴紅鲌的基本組成為：蛋白質(zhì)15．74g／100g、粗脂肪4．60g／100g、水分72．39g／100g和灰分0．98g／100g。

中性蛋白酶(60000U／g）、堿性蛋白酶(10000U／g）、木瓜蛋白酶(500000U／g）、茚三酮、乙酸、乙酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、考馬斯亮藍G-250、無水乙醚均為化學純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；牛血清、抗壞血酸、亮氨酸均為分析純，天津市百世化工有限公司生產(chǎn)。

HH-4數(shù)控恒溫水浴鍋、離心機為常州圓華電器有限公司生產(chǎn)；UV-1800紫外可見分光光度計為上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn)；101A-3型電熱鼓風干燥箱為武漢教學儀器總廠生產(chǎn)；PL303 1／1000電子天平為梅特勒托利多儀器(上海）有限公司生產(chǎn)。

1．2 方法

將翹嘴紅鲌經(jīng)去頭、去尾、去內(nèi)臟、去魚鱗的預處理，清洗，瀝干水分，絞碎成魚肉。

采用常壓干燥法GB-64351986測定魚肉水分、高溫灼燒法GB／T5009．4-1985測定魚肉總灰分、索氏抽提法GB／T5512-1985測定魚肉粗脂肪、考馬斯亮藍G-250染色法測定魚肉蛋白質(zhì)。

稱取一定量絞碎的魚肉，按比例加入適量的蒸餾水，用2mol／L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)至合適的pH，恒溫水浴一定時間，水解結(jié)束后沸水浴滅酶10min，于4000r／min離心10min，上清液即酶解液。

水解液中的游離氨基態(tài)氮含量采用茚三酮法，以亮氨酸為標準品在520nm處比色測定光密度。標準樣品測定后經(jīng)回歸處理得到氨基酸含量(x，μg／mL）與光密度(y）的直線回歸方程為：y＝0．1348x-1．0714×10-4（R2＝0．9993）。根據(jù)此直線回歸方程計算水解液中的游離氨基態(tài)氮含量，再按下式計算水解度：水解度(%）＝(上清液中的游離氨基態(tài)氮含量／原料中總蛋白質(zhì)含量）×100%。

通過單因素試驗考察中性蛋白酶(溫度50℃、pH 7．0）、堿性蛋白酶(溫度50℃、pH 9．0）、木瓜蛋白酶(溫度50℃、pH 7．0）3種酶的反應條件對翹嘴紅鲌肉蛋白水解度的影響，通過正交試驗優(yōu)化其水解條件。

單因素試驗條件：（1）在加酶量2400U／g，溫度50℃，時間2h，料液比1∶5條件下，考察pH分別為5、6、7、8、9、10時對翹嘴紅鲌肉蛋白水解度的影響。（2）在溫度50℃，時間2h，料液比1∶5、pH為7（堿性蛋白酶為9）條件下，考察加酶量分別為1200、2400、3600、4800、6000U／g時對翹嘴紅鲌肉蛋白水解度的影響。（3）在加酶量2400U／g，溫度50℃，時間2h，pH為7（堿性蛋白酶為9）條件下，考察料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7時對翹嘴紅鲌肉蛋白水解度的影響。（4）在加酶量2400U／g，時間2h，料液比1∶5、pH為7（堿性蛋白酶為9）條件下，考察水解溫度分別為40、45、50、55、60℃時對翹嘴紅鲌肉蛋白水解度的影響。（5）在加酶量2400U／g，溫度50℃，料液比1∶5、pH為7（堿性蛋白酶為9）條件下，考察水解時間分別為1、2、4、6、8h時對翹嘴紅鲌肉蛋白水解度的影響。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以水解度為試驗指標，以pH、加酶量、料液比、水解溫度和水解時間為因素，通過L16（45）正交設(shè)計優(yōu)化3種酶的水解條件。

2 結(jié)果與分析

2．1 pH對水解度的影響

圖1 不同pH條件下翹嘴紅鲌肉蛋白的水解度

2．2 加酶量對水解度的影響

圖1是3種酶在溫度50℃、料液比1∶5、加酶量2400U／g、不同pH條件下水解2h，沸水浴滅酶后測得的水解度結(jié)果。

對環(huán)境酸堿度敏感是酶的特點之一，每一種酶只能在一定pH條件下才表現(xiàn)出其最大的酶活性。各種酶的最適pH都不同。過酸或過堿都會影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至導致酶變性失活[5]。由圖1可知，隨著pH的增加，3種酶的水解度呈先上升后下降的趨勢。中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最適pH 分別為7．0、9．0、7．0。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶在各自適宜的pH和反應溫度50℃、相同的料液比1∶5，不同的加酶量條件下水解小翹嘴紅鲌肉蛋白2h，圖2為測得的水解度結(jié)果。

由圖2可知，隨著酶用量的增加，3種酶的水解度值逐漸上升，但當加酶量達到一定量時，水解度值反而減小。加酶量過大時，能與酶反應的底物的位點不足，酶出現(xiàn)過量的現(xiàn)象。因此可以確定3種酶的適宜添加量分別為3600、3600、4800U／g。

圖2 不同加酶量下翹嘴紅鲌肉蛋白的水解度

2．3 料液比對水解度的影響

在加酶量為2400U／g、溫度50℃，各種酶在各自適宜pH，不同料液比條件下水解2h后沸水浴滅酶，測得其水解度結(jié)果如圖3。

由圖3可知，隨著溶劑的增多，水解度呈先上升后下降趨勢。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最適料液比為1∶4，堿性蛋白酶最適料液比為1∶5。

2．4 水解溫度對水解度的影響

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶加酶量均為2400U／g、料液比為1∶5，在各自適宜pH，不同溫度條件下水解2h，沸水浴滅酶后測得其水解度結(jié)果如圖4。

從圖4可知，水解度呈先上升后下降趨勢。在低于最適溫度時，水解度隨溫度升高而上升；當高于最適溫度時，酶活性有一定程度喪失，導致水解度下降。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最適溫度為50℃，堿性蛋白酶的最適溫度為45℃。

圖3 不同料液比下翹嘴紅鲌肉蛋白的水解度

2．6 水解時間對水解度的影響

3種酶在各自適宜的條件下，水解不同的時間，水解度結(jié)果如圖5。從圖5可知，隨著水解時間的延長，水解度不斷升高，中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最適水解時間分別為6h、8h、6h。

圖4 不同水解溫度下翹嘴紅鲌肉蛋白的水解度

圖5 不同水解時間下翹嘴紅鲌肉蛋白的水解度

2．6 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以水解度為試驗指標進行正交試驗，選取L16（45）正交表，因素水平設(shè)置如表1所示。

表1 正交試驗因素水平

正交試驗結(jié)果分析如表2所示。由表2可知，中性蛋白酶水解翹嘴紅鲌肉蛋白的主次因素是pH＞溫度＞料液比＞加酶量＞時間。即pH因素影響最大，溫度因素次之，而后是料液比因素，加酶量因素影響較小，時間因素的影響最小。根據(jù)正交試驗結(jié)果，初步確定中性蛋白酶的最佳水解工藝參數(shù)為：最適溫度為50℃，最適時間為8h，最適加酶量為3600U／g，最適料液比是1∶4，最適pH 7．0。

堿性蛋白酶水解翹嘴紅鲌肉蛋白的主次因素是時間＞溫度＞pH＞料液比＞加酶量。即時間因素影響最大，溫度因素次之，而后是pH因素，料液比因素影響較小，加酶量因素的影響最小。根據(jù)正交試驗結(jié)果，初步確定堿性蛋白酶的最佳水解工藝參數(shù)為：最適溫度為45℃，最適時間為8h，最適加酶量為3600U／g，最適料液比是1∶5，最適pH 9．0。

表2 正交試驗結(jié)果

木瓜蛋白酶水解小翹嘴紅鲌肉蛋白的主次因素是pH＞溫度＞加酶量＞料液比＞時間。即pH因素影響最大，溫度因素次之，而后是加酶量因素，料液比因素影響較小，時間因素的影響最小。根據(jù)正交試驗結(jié)果，初步確定木瓜蛋白酶的最佳水解工藝參數(shù)為：最適溫度為50℃，最適時間為8h，最適加酶量為4800U／g，最適料液比是1∶4，最適pH 6．5。

在單因素試驗和正交試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)所得的最佳水平組合做驗證試驗。中性蛋白酶在最佳水平組合條件下，水解度達到13．64%；堿性蛋白酶達到21．27%；木瓜蛋白酶達到16．42%。采用最佳水平組合后，其水解度大有提高。

3 結(jié)論

魚蛋白經(jīng)水解作用后，其功能和品質(zhì)可得到更大的提高，所以，酶水解法為低值魚深加工提供了一條有效的途徑。本研究以翹嘴紅鲌為低值魚代表，得出了其魚肉3種酶類酶解工藝。具體為中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶最適水解條件分別是溫度50、45、50℃，時間8、8、8h，加酶量3600、3600、4800U／g，料液比1∶4、1∶5、1∶4，和pH 7．0、9．0、6．5。

[1]趙占西．我國淡水水產(chǎn)品加工業(yè)的現(xiàn)狀和前景展望 [J]．河海大學常州分校學報，2001，24（12）：30-37．

[2]戴新明，熊善柏．湖北省淡水魚加工與綜合利用 [J]．漁業(yè)現(xiàn)代化，2004，8（3）：14-17．

[3]光翠娥，黃 敏．加強淡水魚的加工與綜合利用 [J]．食品研究與開發(fā)，2005，32（3）：25-27．

[4]孔繁東，任雪嬌，祖國仁，等．低值魚調(diào)味品的研究進展 [J]．中國釀造，2010，（2）：11-12．

[5]Liaset B，Lied E，Espe M，et al．Enzymatic hydrolysis of by-products from the fish-filleting industry：chemical characterisation and nutritional evaluation[J]．Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80：9-10．