對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法檢測水溶液中常微量尿素

苗曉杰，蔣恩臣，王 佳，杜衍紅

（華南農業大學工程學院，廣州 510640）

目前，國內外測定尿素含量的方法主要有尿素酶法[1]、硫酸消煮甲醛法和二乙酰單肟比色法[2]。尿素酶法是在一定酸度的溶液中用尿素酶將尿素態氮轉化為氨，再用硫酸標準溶液滴定。此方法用于檢測含有尿素酶活性抑制劑的緩釋尿素時存在反應時間長，轉化不完全等問題，使得測試值和真實值之間有很大差異[3]。硫酸消煮甲醛法則操作繁瑣，滴定終點不易判斷，其中使用的化學試劑甲醛對人體腎臟、眼膜等器官都有損害[4]。二乙酰單肟比色法檢測限低，可以測定微量尿素，但是其操作步驟繁瑣，熱穩定性差，精密度和準確度都不夠理想。

對二甲氨基苯甲醛能夠在酸性條件下和尿素反應生成檸檬黃色物質，可依此用比色法測定尿素含量[5－6]。雖然有些研究者據此提出一些具體檢測方法[3－4,7－8]，但大多存在所用試劑定量不夠精確，操作步驟不夠清晰等問題，本文在參考國內外有關資料的基礎上，多次進行實驗和探索論證，提出了以對二甲氨基苯甲醛為顯色劑，利用分光光度法檢測水中常量尿素的具體可行方法。

1 實驗原理

根據Ehrlich反應原理，對二甲氨基苯甲醛[（CH3）2NC6H4CHO]可以和各種含氮有機化合物發生顯色反應。對二甲氨基苯甲醛與尿素 [(NH2)2CO]反應可生成檸檬黃色物質。其反應方程式為：

2 試驗材料與儀器

可見分光光度計（V－1100，上海美譜達儀器有限公司）；

25 mL比色管，1 cm玻璃比色皿；

無水乙醇（分析純），對二甲氨基苯甲醛（分析純），硫酸（分析純），尿素（分析純）；

對二甲氨基苯甲醛（PDAB）顯色劑：稱取20.00 g對二甲氨基苯甲醛溶解于1 000 mL無水乙醇中；

2 mol·L－1硫酸溶液：按 V（濃硫酸）∶V（水）=1∶8配制；

1 000 μg·mL－1尿素標準溶液：稱取 1.000 g（稱準至0.0001 g）尿素溶解于1 000 mL去離子水中。

3 試驗方法與結果分析

3.1 條件試驗

3.1.1 波長的選擇

取 10 mL 1 000 μg·mL－1的尿素標準溶液加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液3 mL，再加入2 mL去離子水，混合搖勻，靜置10 min。然后以空白試劑為參比，在不同波長下測定其吸光度。空白試劑的配制方法為：取10 mL去離子水加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液3 mL，再加入2 mL去離子水，混合搖勻，靜置10 min。所得試驗結果如圖1所示。

圖1 尿素與對二甲氨基苯甲醛反應溶液在不同波長下的吸光度Fig.1 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea under different wavelength

從圖中的函數圖像以及對應的點的坐標數據可以看出，尿素樣品反應溶液在400～460 nm范圍內有一個強烈的吸收峰，在422 nm處有最大吸收值1.545。故選用422 nm作為試驗所用波長。

3.1.2 PDAB顯色劑用量的選擇

固定 1 000 μg·mL－1尿素標準溶液加入量 10 mL，2.0 mL·L－1硫酸溶液加入量3 mL，改變PDAB顯色劑的用量，用去離子水定容至25 mL，在比色管中混合均勻靜置10 min后，在422 nm下測定反應溶液的吸光度以及對應空白試劑的吸光度，此處對應空白試劑是指以等量去離子水代替尿素標準溶液，其余配比跟對應樣品溶液相同。所得試驗數據如表1所示。

表1 PDAB顯色劑用量對尿素與對二甲氨基苯甲醛反應溶液吸光度的影響Table 1 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of PDAB

在給定條件下，隨著PDAB顯色劑加入量的增大，反應溶液的吸光度不斷增大，在PDAB顯色劑為10 mL時達到最大值，而后開始減小。空白試劑的吸光度則隨PDAB顯色劑加入量的增大而不斷增大。根據樣品反應溶液的吸收盡量大，空白試劑的吸收盡量小的原則，選定10 mL作為PDAB顯色劑的用量。

3.1.3 硫酸溶液用量的選擇

固定 1 000 μg·mL－1尿素標準溶液加入量 10 mL，PDAB 顯色劑的用量 10 mL，改變 2.0 mol·L－1硫酸溶液加入量，用去離子水定容至25 mL，在比色管中混合均勻靜置10 min后，在422 nm下測定反應溶液的吸光度以及對應空白試劑的吸光度，此處對應空白試劑是指以等量去離子水代替尿素標準溶液，其余配比跟對應樣品溶液相同。所得試驗數據如表2所示。

表2 硫酸溶液用量對尿素與對二甲氨基苯甲醛反應溶液吸光度的影響Table 2 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of sulfuric acid

在給定條件下，隨著硫酸溶液加入量的增大，反應溶液的吸光度不斷增大，在硫酸溶液從4 mL變化到5 mL時增幅急劇減小。空白試劑的吸光度隨硫酸溶液加入量的增大而增大，在硫酸溶液從4 mL變化到5 mL時增幅也急劇減小。在硫酸溶液為4 mL時，反應溶液和空白試劑的吸光度之差為1.561，硫酸溶液為5 mL時，反應溶液和空白試劑的吸光度之差為1.560。測定尿素含量時若以空白試劑做參比，過強的背景吸收必然增大樣品吸光度的離差，直接影響方法的精度和檢出能力。根據樣品反應溶液的吸收盡量大，空白試劑的吸收盡量小的原則，選定4 mL作為硫酸溶液加入量。

3.1.4 顯色反應時間的選擇

取 10 mL 1 000 μg·mL－1的尿素標準溶液加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液4 mL，再加入1 mL去離子水，混合搖勻。然后在440 nm下，以去離子水為參比，測定其不同時間吸光度，同時測定空白試劑的吸光度。空白試劑的配制方法為：取10 mL去離子水加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液 4 mL，再加入 1 mL去離子水，混合搖勻。所得試驗數據如表3所示。

尿素與對二甲氨基苯甲醛反應，溶液顯色反應在5 min內即可基本完成，在反應時間為10～600 min內，顯色溶液的吸光度非常穩定，長時間放置后所測結果會稍微有所增大。綜合以上分析，確定顯色反應時間為10 min。

表3 尿素與對二甲氨基苯甲醛反應溶液在不同顯色時間下的吸光度Table 3 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by reaction time

3.2 標準曲線和測試方法的建立

3.2.1 標準曲線

取 8 支 25 mL 比色管，分別加入 1 000 μg·mL－1的尿素標準溶液 0、0.5、1、2、4、5、8、10 mL，然后分別補充去離子水10、9.5、9、8、6、5、2、0 mL定容到10 mL刻度處，由此可以得到各為10 mL的尿素含量分別為0、50、100、200、400、500、800、1 000 μg·mL－1的系列溶液。然后在每支比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1的硫酸溶液4 mL，然后加入去離子水定容至25 mL刻度處，混合搖勻，靜置10 min。然后以第一支比色管的反應溶液（即空白試劑）做參比溶液，在422 nm下分別測定8支比色管反應溶液的吸光度。所得結果如表4所示。

通過數據分析軟件SPSS（13.0版本）進行線性回歸分析，得到顯色溶液吸光度Y與尿素含量X（μg·mL-1）的關系式：X（尿素濃度，μg·mL-1）=628.871*Y（吸光度）-5.742（R=1.000，R2=1.000），兩者呈現出極顯著的線性關系。回歸直線如圖2所示。

表4 不同濃度尿素與對二甲氨基苯甲醛反應溶液的吸光度Table 4 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of sulfuric acid

圖2 對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量標準曲線Fig.2 Standard curve of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

3.2.2 測試方法

取待測樣品溶液10 mL加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L-1的硫酸溶液4 mL，然后加入去離子水定容至25 mL刻度處，混合搖勻，靜置10 min后，在422 nm下，以空白試劑為參比，測定其吸光度。然后把吸光度帶入到標準曲線方程式中，通過換算就可求出待測樣品所含尿素濃度。空白試劑的配制方法為：取10 mL去離子水加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L-1硫酸溶液4 mL，再加入1 mL去離子水，混合搖勻，靜置10 min。若待測樣品尿素含量濃度過高，則可以適當稀釋后再進行顯色測定。

3.3 精密度與準確度試驗

分別配制低中高6種濃度的尿素標準溶液，以空白試劑做參比溶液，在前文所選定的試驗條件下分別測定吸光度，每個樣品溶液重復測定8次，結果見表5。

表5 對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量精密度與準確度試驗Table 5 Precision and accuracy experiment of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

然后把測得的吸光度值帶入標準曲線方程求得尿素濃度，利用數據分析軟件SPSS（13.0版本）計算平均值并進行誤差和偏差分析，同時與利用二乙酰單肟比色法方法測得的數值進行對比。結果見表6。

表6 對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量精密度與準確度試驗Table 6 Precision and accuracy experiment of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

從數據軟件分析結果可以看出，利用對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量，由標準曲線求得的尿素濃度平均值與標準樣品的尿素濃度的絕對誤差較小，相對誤差低于0.51%，中高濃度相對誤差不超過0.30%。標準偏差較低，相對標準偏差（變異系數）不超過10‰，表明方法具有較高的精密度和準確度。階梯加標回收率在99.08%～100.74%之間，表明可以采用線性校準方法，標準曲線具有較高的穩定性和可靠性[9]。與二乙酰單肟比色法方法測得的值比較可以看出，對同一濃度樣品，兩種方法測定的結果差別不大，這從另一方面驗證了對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量的準確性和可靠性。

3.4 檢出限和干擾分析

利用對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量，顯色溶液吸光度與尿素含量兩者呈現出極顯著的線性關系。根據分光光度法檢出限的確定原則[10]，一般以能給出吸光度為0.010的溶液濃度為檢出限。把這一數值帶入所建立的標準曲線方程，可以求得本方法的檢出限為0.5 μg·mL－1，若檢測高濃度尿素溶液，可以先進行適當稀釋；檢測超低濃度的尿素溶液，可以配制更低濃度的標準尿素溶液，建立新的標準曲線或者選擇其他方法。

關于測試樣品中干擾的問題通常有以下情況：①氨的干擾。氨的干擾在于消耗酸，通過酸度改變使樣品和試劑的色度發生變化。酸度降低時，溶液吸光度會下降，但氨溶于水后生成的銨離子對色度具有微弱的增強作用，可以部分補償溶液色度的降低。此外可以采用加大酸用量的方法消除氨的影響。②聯氨的干擾。低濃度的聯氨不會產生干擾，因為對二甲氨基苯甲醛對尿素的敏感度遠遠大于聯氨，若樣品中有較高濃度聯氨存在時，可以采用加碘氧化法除去。③Fe3+的干擾。Fe3+在水溶液中顯黃色，其色度會對測試結果產生影響，可以借助還原劑（抗壞血酸、鹽酸羥胺等）將Fe3+還原為Fe2+消除其影響。對于普通水溶液中常見的其他物質，尚未發現干擾。

4 結論

本文通過條件試驗，精密度和準確度試驗，建立了對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量的標準曲線和操作步驟。利用對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測定尿素含量具有精密度高、準確度高、穩定性好、操作性強、步驟簡便等優點，適用于水溶液中常微量尿素含量的測定。

[1] GB－T 3598－1983,肥料中尿素態氮含量的測定－尿素酶法[S].北京:中國標準出版社,1983.

[2] 魯如坤.土壤農業化學分析方法[M].北京:中國農業科技出版社,2000：352－356.

[3] 丁雪紅,劉柏智,牛進龍.緩釋尿素中尿素含量的測定[J].化肥工業,2006,33(3):35－36.

[4] 陳錄華.對二甲氨基苯甲醛法測定常量尿素[J].大氮肥,1998,21(6):422－424.

[5] Knorst M T,Neubert R,Wohlrab W.Analytical methods for measuring urea in pharmaceutical formulations[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1997,15(11):1627－1632.

[6] Hussain I,Mahmood Z,Yasmeen R.et al.Assay of urea with paradimethyl－amino－benzaldehyde[J].Journal of the Chemical society of Pakistan,2002,24(2):122－129.

[7] 李敏,鄭長立,張勇.對二甲氨基苯甲醛比色法測定解析廢液中的微量尿素[J].化工技術與開發，2005,34(3):42－43,53.

[8] 劉志剛,趙慶良,孫麗欣等.PDAB比色法直接測定液相中的常量尿素[J].哈爾濱工業大學學報.2008,40(8):1214－1217.

[9] 馮秀文,高俊琴.用回收率檢驗分析方法的準確度[J].光譜學與光譜分析，1995,15(3):87－90.

[10] 鐘佩珩,郭璇華,黃如杕，等.分析化學[M].北京:化學工業出版社,2001：98－117.