乳源降血壓七肽基因在畢赤酵母中的表達研究

韓建春，李名遠，李 杰

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030;2.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

抗高血壓肽（Antihypertensive peptide，AHP）是血管緊張素轉化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制劑，可通過抑制人體血管緊張素Ⅱ的生成達到降低血壓的目的[1]。它源于食品，能夠降低人體血壓，且毒副作用小[2－4]。近年來很多研究采用酶解法已從牛奶、乳酪、大豆等不同的天然蛋白質中獲取得到了具有較好ACE抑制活性的酶解抗高血壓肽，但其提取步驟繁瑣、產率低，限制了抗高血壓肽的研究和開發[5－6]。基因工程技術的發展為降血壓肽的開發利用帶來了契機。利用基因工程技術來生產食品原料、藥物已越來越多，為利用基因工程技術制備抗高血壓肽提供了很好的借鑒[7－9]。目前，國內這方面的研究還正處于起步階段，研究報道不多?；蚬こ讨苽淇垢哐獕弘目朔酥苯訌膭?、植物、微生物原料中分離提取抗高血壓肽篩選水解酶類的盲目性（特異性蛋白水解酶事先選定），以及純化工藝的復雜繁瑣性，而且不受原料來源的限制，生產周期短，下游分離純化工藝簡單，便于進行大規模生產等優勢，因此，具有廣闊的應用前景。

本研究根據Maruyama等[10]于1982年報道，在牛乳酪蛋白的胰蛋白水解物中分離到了一種在體外具有ACE抑制活性的抗高血壓生物活性七肽，經動物體內實驗已經證明具有降低血壓作用[11－12]。利用基因工程技術，根據畢赤酵母密碼子偏愛性，人工合成了具有較高活性的抗高血壓七肽串聯基因序列，并構建酵母表達載體，轉化畢赤酵母GS115。進一步對表達的蛋白進行分析，為抗高血壓七肽的工業化生產和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種及載體

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115由本實驗室保存；pPIC9載體由本實驗室保存。

1.1.2 試劑及酶類

DNA片段回收試劑盒（鼎國生物工程公司）；ACE和底物馬尿酸酰組氨酸酰亮氨酸（Sigma公司）；限制性內切酶、T4DNA連接酶、rTaq酶、dNTPs（大連寶生物工程公司TaKaRa）；T載體（Promega公司）；其他化學試劑皆為分析純。

1.1.3 主要儀器設備

BIO－RAD Mini－PROTEIN3 蛋白質電泳系統；Amersham Biosciences Ultrospec 1100pro紫外分光光度計；BIO－RAD PTC－200 PCR儀；OMEGA 10TM凝膠成像系統。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗高血壓七肽串聯基因的合成

合成抗高血壓七肽串聯基因的引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：

AHSP－1：5′CTCGAGAAAAGAGAGGCTG3′XhoⅠAHSP－2：5′CTGGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT GCTGTTCCATACCCACAAAG 3′

AHSP－3：5′TTTGTGGGTATGGAACAGCTCTTT GTGGGTATGGGACAGCTCTTTGTGGGTATGGAAC3′

AHSP－4：5′GCGGCCGCTTATCTTTGTGGGTATG GAACAG3′NotⅠ

合成分兩輪PCR進行，第一輪是引物AHSP－1、AHSP－2進行PCR反應，第二輪是以第一輪PCR產物為模板，引物AHSP－1、AHSP－3進行PCR反應?；厥?50～500 bp的PCR產物加A后連接T載體，轉化DH5α中。挑取單菌落，在Amp+的LB培養基中培養，取過夜培養物，提取質粒，并酶切電泳初步鑒定，選出陽性菌株，送上海生工生物工程技術有限公司測序。目的基因片段的回收、酶切、連接、轉化均按基因工程常規方法操作。

1.2.2 畢赤酵母重組質粒表達載體的構建

利用XhoⅠ和NotⅠ酶切陽性克隆得到的串聯基因片段，經0.8%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳后回收。將其與同樣經XhoⅠ和NotⅠ酶切的表達載體pPIC9按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶，16℃連接過夜。然后轉化DH5α，挑取轉化子于LB液體培養基37℃，200 r·min－1振蕩培養過夜，提取質粒，并用適當的限制性內切酶酶切鑒定。

1.2.3 目的蛋白的表達

①挑選鑒定正確的單菌落，置于裝有25 mL BMG培養基的250 mL搖瓶中，于28～30℃，250～300 r·min－1培養至 OD600=2.000～6.000（約 16～18 h）。

② 室溫下 1 500～3 000 r·min－1離心 5 min，收集菌體，用BMM重懸菌體，使OD600=1.000左右（約 100～200 mL）；

③將步驟2所得的菌液置于1 L的搖瓶中，用雙層紗布封口，30 ℃、250～300 r·min－1繼續生長；

④每24 h向培養基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%～1.0%；

⑤按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1 mL，置于1.5 mL離心管中，最大轉速離心2～3 min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間[13]。

1.2.4 表達產物濃縮

用TCA沉淀法濃縮畢赤酵母表達上清中的蛋白：

① 取誘導表達的菌液 1.5 mL，13 000 r·min－1，離心2 min，收集上清；

②取l mL上清置于1.5 mL離心管中，加入100 μL 100%TCA（預先放于4℃），顛倒混勻數次；

③樣品置于冰浴中大約30 min（或在冰箱內放置 15 min）；

④ 13 000 r·min－1，離心 10 min，可見有棕褐色沉淀，倒掉上清;

⑤將離心管倒扣在吸水紙上，于37℃烘箱烘干10～20 min，待管底無明顯液體殘留時，加入200 μL冰冷的丙酮（預先放于－20℃），輕彈離心管的管壁，洗去管底和管壁殘留的TCA；

⑥ 13 000 r·min－1，離心 10 min，用 20 μL 槍頭吸凈管底殘留的液體（操作盡量要快，不然沉淀容易散開，影響蛋白回收率），將離心管倒置于吸水紙上，37℃烘箱烘干5 min，確認管壁和管底沒有液體殘留；

⑦加入20～50 μL凝膠加樣緩沖液，95℃加熱10min使沉淀溶解，也可用手指輕彈管壁或用20μL槍頭吹打，以促進蛋白溶解。

1.2.5 半抑制濃度的測定

將表達蛋白水解物冷凍干燥，用BBS溶液將其溶解配成試驗需要濃度的溶液，按照水解物ACE抑制率的檢測方法測定其抑制活性，以濃度為橫坐標，ACE抑制率為縱坐標繪制曲線，使用Origin 7.5軟件中的多項式擬合程序對曲線進行擬合，從得到的擬合方程中計算出當ACE抑制率為50%時，水解物的濃度即為半抑制濃度值（IC50）。

1.2.6 表達產物ACE抑制活性的檢測

在Nakamura等方法上進行改進[14－15]。具體見表1。

表1 表達產物ACE抑制活性的檢測Table 1 Assay of ACE inhibitory activities （μL）

將 ACE 酶底物 Hip－His－Leu（HHL）溶于 0.1 mol·L－1的含 0.3 mol·L－1NaCl的硼酸緩沖液中（pH 8.3），配制成5mmol·L－1的濃度。取100μL5mmol·L－1Hip－His－Leu 溶液，與 40 μL ACE 抑制肽（胰蛋白酶水解產物）混合（預先將水解產物pH調至8.3），在37℃條件下溫育3 min。加入10 μL的0.1 U·mL－1的ACE酶（用去離子水配制），37℃條件下反應30 min，加 250 μL，1 mol·L－1的 HCl終止反應。然后在反應體系中加入1.0 mL乙酸乙酯萃取馬尿酸，旋渦混合 15 s，在 10 000 r·min－1下離心 10 min，將上層的乙酸乙酯0.7 mL轉移到一個干凈的5 mL青霉素小瓶中，于120℃的干燥箱中干燥15 min，加熱除去乙酸乙酯。然后再用5 mL的去離子水溶解馬尿酸，在228 nm處測量其OD值。ACE酶的抑制程度用百分比來表示，計算方法為：

式中，A表示ACE及ACE抑制物都存在的條件下的OD值（實測值）；B表示ACE抑制物不參與反應的條件下測得的OD值（對照值）；C表示ACE不參與反應的條件下的OD值（空白值）。

2 結果與分析

2.1 抗高血壓七肽串聯基因的合成

抗高血壓七肽串聯基因AHP7P的合成如圖1和 2所示。圖1是引物 AHSP－2、AHSP－3進行PCR結果，圖2是利用引物AHSP－1與AHSP－4及前步PCR產物的連續重疊延伸獲得不同長度的含抗高血壓七肽串聯序列。從圖1可以看出，第一輪PCR獲得100～1 000 bp的彌散擴增片段，符合預期結果。圖2是以第一輪PCR產物為模板，引物AHSP－1、AHSP－4進行PCR擴增的結果，獲得了100～1 000 bp的彌散擴增產物?；厥?50～500 bp的片段進行加A反應，產物回收后連接pMD18－T載體，轉化大腸桿菌DH5α中。提取質粒進行Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切初步鑒定（見圖3）。經瓊脂糖凝膠電泳分析出現約2 700、250 bp的2條譜帶，表明目的片段成功與T載體連接。將重組質粒命名為pMD－AHP7P，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

重組質粒測序結果為:CTCGAGAAAAGAGAG GCTGAAGCTGCTGTTCCATACCCACAAAGGCTGTT CCATACCCACAAAGAGCTTTCCATACCCACAAAGA GCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTCCCATACCC ACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTTC CATACCCACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAG AGCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTTCCATACC CACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTC CCATACCCACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAG ATAAGCGGCCGC

圖1 第一輪PCR產物Fig.1 PCR product of the first cycle

圖2 第二輪PCR產物Fig.2 PCR product of the secend cycle

預測由該基因編碼的多肽鏈氨基酸序列為：Leu－Glu－Lys－Arg－Glu－Ala－Glu－Ala－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－***－Ala－Ala，即 Leu－Glu－Lys－Arg－Glu－Ala－Glu－Ala－（Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg）13。其中 Leu－Glu－Lys－Arg－Glu－Ala－Glu－Ala 為信號肽切割位點，經畢赤酵母自身信號肽酶切割后分泌蛋白序列為（Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg）13。該序列經胰蛋白酶酶解將獲得抗高血壓七肽 Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg。表明已成功獲得抗高血壓七肽串聯基因序列。

圖3 pMD-AHP7P載體Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定結果Fig.3 Identification of vector pMD-AHP7P by Eco RⅠand HindⅢ

2.2 抗高血壓七肽串聯基因畢赤酵母表達載體的構建

用 XhoⅠ和 NotⅠ雙酶切質粒 pMD－AHP7P，回收300 bp的目的片段。將pPIC9載體同樣用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收載體大片段。將兩個回收的片段連接構建表達載體pPIC9－AHP7P，載體構建過程見圖4。轉化大腸桿菌DH5α，得到的轉化子用Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，切出約560 bp條帶，說明載體構建正確。鑒定正確的轉化子用于下一步試驗，酶切鑒定結果見圖5。

圖4 pPIC9-AHP7P載體的構建Fig.4 Construction of vector pPIC9-AHP7P

2.3 畢赤酵母的轉化

將構建好的表達載體pPIC9－AHP7P用BglⅡ酶線性化，酶切結果見圖6，回收約7.0 kb的片段。制備畢赤酵母GS115菌株的感受態，通過電擊將回收的線性化片段轉入畢赤酵母中，在MD固體培養基上培養，結果見圖7。

采用反復凍融法裂解酵母，取裂解產物直接進行PCR，并以pPIC9－AHP7P載體質粒為陽性對照，空載體為陰性對照。結果得到的2個酵母轉化子均為陽性。PCR結果見圖8。

2.4 畢赤酵母誘導表達蛋白的SDS-PAGE檢測

將表達載體pPIC9－AHP7P轉化畢赤酵母菌株，然后接于BMG培養基中培養至OD600=2.000～6.000（約16～18 h），收集菌體，用BMM培養基重懸菌體，使OD600=1.000左右（約100～200 mL）。每24 h向培養基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%～1.0%，誘導菌株經超聲波破碎處理，進行SDS－PAGE分析。SDS－PAGE分析表明（見圖9），與未經誘導的對照以及誘導的pPIC9空載體對照相比，經誘導的重組菌有明顯的重組蛋白表達帶。經計算目的蛋白分子質量約為12 ku。電泳結果與預計相符。

圖5 pPIC9-AHP7P載體Bam H I和NotⅠ雙酶切鑒定結果Fig.5 Identification of vector pPIC9-AHP7P by Bam H I and NotⅠ

圖6 pPIC9-AHP7P載體BglⅡ酶切線性化結果Fig.6 Digestion of vector pPIC9-AHP7P by BglⅡ

2.5 半抑制濃度的測定

在評價食源性ACE抑制肽活性強弱時，IC50值是不依附與樣品濃度，最直觀的評價指標，為了更加準確地評價表達蛋白水解物對ACE抑制活性的大小，進行了不同純化階段的表達蛋白水解物ACE抑制肽的IC50值測定。以樣品濃度為橫坐標，該濃度下樣品ACE抑制率為縱坐標繪制曲線，如圖10所示。從圖10中可以看出，隨著樣品濃度的增加，ACE抑制活性逐漸增大，說明樣品濃度與其ACE抑制活性有一定的效應關系，但當濃度增加到一定時，ACE抑制活性趨于穩定。通過Origin 7.5軟件進行回歸分析得到擬合出的方程，通過方程計算出當ACE抑制率為50%時樣品的濃度，即為樣品的IC50值，由方程可以算出樣品的IC50值為0.0203 mg·mL－1。

圖7 pPIC9-AHP7P載體電擊轉化畢赤酵母結果Fig.7 Result of vector pPIC9-AHP7P transformation into Pichia pastoris by electroporation

圖8 轉化子PCR鑒定結果Fig.8 Identification of transformants by PCR

2.6 表達產物的ACE抑制活性

表達產物經胰蛋白酶水解后，體外ACE酶抑制活性研究表明，水解產物的ACE酶活性的抑制率達65.12%，具有抗高血壓肽活性。

圖9 重組表達抗高血壓肽的SDS-PAGE分析Fig.9 Analysis of recombinant expressed antihypertensive peptide by SDS-PAG

M-低分子質量蛋白Marker；1-甲醇誘導的pPIC9-AHP7P菌株上清；2-甲醇誘導pPIC9-AHP7P菌株沉淀；3-沒有誘導的pPIC9-AHP7P菌株上清；4-誘導的pPIC9菌株上清

M-Standard protein molecular weight；1-Recombinant supernate strain pPIC9AHP7P induced by Methanol；2-Recombinant precipitation strain pPIC9-AHP7P induced by methanol；3-Uninduced recombinant supernate strain pPIC9-AHP7P；4-Supernate strain pPIC9 induced by methanol

圖10 表達蛋白水解物濃度與ACE抑制活性關系曲線Fig.10 Active relations curve of expresses protein hydrolysate density and ACE suppresses

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，現代富貴病發病率逐年上升，高血壓已成為危及人們身體健康的主要的疾病。利用血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物抑制ACE的活性是臨床治療高血壓的重要途徑[15]。目前已有十幾種化學合成藥物作為降血壓藥物用于臨床治療，長期服用有一定的副作用[16]。而源于天然食物原料的抗高血壓肽，也是一種有效的ACE抑制劑。通過酶解方法分離制備多種抗高血壓肽國內外已有很多報道[17-19]。但是該方法分離純化過程環節多、產量低，限制了抗高血壓藥品及保健品的產業化[20-21]。當前利用微生物基因工程技術高效表達外源蛋白質及多肽已成為解決從天然原料分離純化蛋白質多肽低效率、低產率的重要技術，因此本研究采用基因工程技構建高表達抗高血壓七肽的基因工程菌。

4 結論

抗高血壓肽屬小分子功能肽，這類多肽由于比較短?。ㄒ话阒挥袔讉€至十幾個氨基酸），利用基因工程菌表達時存在表達產物易被降解、表達量低等難題[22-25]。本研究通過特定的反常規PCR將引物重疊延伸合成出一條編碼重復七肽序列的串聯基因，將畢赤酵母表達載體pPIC9與PCR合成的目的基因連接，構建了目的基因的酵母表達載體pPIC9-AHP7P。將表達載體pPIC9-AHP7P通過電擊法轉入畢赤酵母，使其在畢赤酵母中表達，通過甲醇誘導，表達產物經胰蛋白酶水解后，體外ACE酶抑制活性研究表明，水解產物的ACE酶活性的抑制率達65.12%。通過試驗確定了畢赤酵母表達蛋白酶切產物IC50值為0.0203 mg·mL-1。基于以上研究重組抗高血壓肽可以進一步研制成為功能性食品乃至降血壓藥物，對提高國民健康水平有極重要的現實意義和廣泛的應用前景。

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