酯交換植物油中甾醇測定方法研究

竇巍巍，胡立志，朱秀清*，陳 昊，于殿宇

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，哈爾濱 150050）

甾醇是一種從植物油工業副產物中得到的天然活性物質，能有效降低有害低密度膽固醇（LDL）的水平，而不影響有益高密度膽固醇（HDL）的水平[1－3]，人體內有益高密度膽固醇（HDL）能將組織及動脈壁上多余的膽固醇運輸到肝臟進行代謝，在機體中起著“清道夫”的作用[4]。甾醇具有降低血膽固醇、抗癌、防治心血管疾病等生理功能[5－6]。在脂肪酶的催化下，通過酯交換反應可大大增加甾醇的脂溶性，能比較方便地添加到油脂或含油脂食品中，近年來在西方國家被廣泛應用[7]。

植物油中甾醇含量的測定方法很多，早期的分析方法有毛地黃皂苷法、Lieberman－Burchard比色法，毛地黃皂苷法所測得含量稍有偏高，且操作安全性要求較高[8]。目前，主要分析方法有氣相色譜法和高效液相色譜法。這些方法分析精度高，可檢測總甾醇含量及甾醇的組成，但儀器操作和維護要求高、標準品價格昂貴[9]。為尋求一種簡單、快捷、準確且低成本的測定方法，對適用于食品中膽固醇檢測的國標鐵礬顯色法進行了試驗研究，依據為：從結構上看，甾醇和膽固醇的結構非常相似，所不同的只是C17支鏈上的結構，實際上兩者發生顏色反應的顯色基團是相同的[10]。本試驗確定顯色反應的最佳測定條件，最終對酯交換植物油中甾醇的含量進行測定。本研究目的是提出一種測定酯交換植物油中甾醇含量的方法，旨在為測定酯交換植物油中甾醇的含量提供快速而簡單的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

油脂樣品：高油酸葵花籽油一級油（購自大連圣基生物制品有限公司），大豆油一級油（購自九三集團哈爾濱惠康食品有限公司），酯交換植物油。

甾醇（純度≥95%）（購自西安藍天生物工程有限責任公司），毛地黃皂甙（購自Sigma公司），其他藥品均為分析純。

1.1.2 國標鐵礬顯色法試劑配制

鐵礬儲備液：將 4.463 g NH4Fe（SO4）2·12H2O溶解于100 mL 85%磷酸中，貯于干燥器內，此液在室溫中穩定。

鐵礬顯色液：吸取鐵礬儲備液10 mL，用濃硫酸定容至100 mL。貯于干燥器內，以防吸水。

1.1.3 儀器

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DK－2000－ⅢL數顯恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；電子天平，北京賽利多斯儀器系統有限公司。

1.2 方法

甾醇總含量的測定：采用國標鐵礬顯色法[11]、Lieberman－Burchard 比色法[12]和毛地黃皂苷法[13]測定酯交換植物油中甾醇的含量。

1.2.1 國標法鐵礬顯色法甾醇標準曲線的測定

根據國標鐵礬顯色法[11]，吸取甾醇標準常備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分別置于10 mL試管內，在各管內加入冰乙酸使總體積皆達4 mL。沿管壁加入2 mL鐵礬顯色液，混勻，室溫下顯色15 min后，于最大吸收波長下測定吸光度，每個點重復3次。以甾醇標準濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 酯交換植物油中甾醇的測定

取酯交換植物油3～4滴，置于25 mL試管內，準確記錄其重量，65℃恒溫水浴中皂化1 h。冷卻后加入3 mL 5%氯化鈉溶液，10 mL石油醚，振搖2 min，靜置分層。取上層石油醚液2 mL，氮氣吹干后，加入4 mL冰乙酸，2 mL鐵礬顯色液，混勻，放置15 min后在最大吸收波長下比色，測得吸光度，在標準曲線上查出相應的甾醇含量。

2 結果與分析

2.1 國標鐵礬顯色法最大吸收波長的確定

取濃度為2 mg·mL－1的甾醇標準樣品適量，按照國標鐵礬顯色法進行處理，并通過分析選擇掃描波長范圍為500～700 nm。采用雙光束紫外可見分光光度計于500～700 nm范圍內掃描，在556 nm處有最大吸收峰，因此，選擇556 nm作為測定吸收波長。吸收曲線見圖1。

圖1 植物甾醇的吸收譜Fig.1 Visible absorption spectrum of phytosterol

2.2 國標鐵礬顯色法測定甾醇總含量標準曲線

根據參考文獻[11]，以甾醇作為標樣繪制標準曲線，結果見圖2。計算其回歸方程為：Y=0.21001X+0.01216，R2=0.9974。相關系數為正，說明吸光值隨甾醇含量增大而增大，其絕對值接近1，兩個變量間的直線相關密切。曲線回歸性好，可用于定量分析。

2.3 國標鐵礬顯色法稀釋倍數的確定

植物油與甾醇酯交換后，植物油中甾醇的含量較高，不在標準曲線可檢測到的范圍內，通過稀釋的方法加以調整。?

圖2 植物甾醇標準曲線Fig.2 Standard curve of phytosterol concentration

酯交換植物油中甾醇含量較高，進行顯色處理使用乙酸稀釋，稀釋倍數為10倍時標準偏差S=0.001，相對標準偏差RSD=1.09%，為最佳稀釋倍數。結果見表1。

2.4 國標鐵礬顯色法最優顯色條件的確定

選取3個對顯色過程影響較大的因素（即顯色時間、顯色劑用量、顯色劑的組成比例-鐵礬儲備液：濃硫酸）為研究對象，以甾醇含量為考察指標進行正交試驗，其因素水平見表2。

2.5 正交試驗設計

選擇適宜的因素和水平進行正交試驗設計，分別準確稱取油樣100.0 mg，改變反應的時間、顯色劑用量、顯色劑組成比例3個因素，按照表2給出的因素水平編碼表，以酯交換植物油中甾醇含量為指標，進行正交試驗設計，優化顯色反應條件。

表1 稀釋倍數分析結果Table 1 Influence analysis of dilution multiple on detecting results

表2 因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2.6 正交試驗結果分析

由表3可以看出，影響顯色反應的因素的主次關系為：顯色劑用量B＞顯色劑組成比例（C）＞顯色時間A。其中顯色劑用量（B）是影響顯色反應的最主要因素。其次，影響顯色反應的因素為顯色劑組成比例（C），顯色劑組成中濃硫酸含量較高，操作時應注意安全。顯色時間（C）對顯色反應也有一定的影響，最佳顯色時間為15 min。通過以上分析可確定最佳反應條件為A1B2C1，即顯色劑用量2 mL，顯色劑組成比例1∶9，顯色時間15 min，在最佳反應條件下進行驗證試驗，所得甾醇含量為0.0914%。

2.7 國標鐵礬顯色法測定植物甾醇總含量

采用國標鐵礬顯色法、Lieberman-Burchard比色法和毛地黃皂甙法測定了4種油樣（A高油酸葵花籽油，B大豆油，自制油樣C、D為油樣A、B分別對應的高含量甾醇的酯交換植物油），三種方法測得的結果見表4。由表4可以看出，三種方法的測定結果的精密度都較高。

表3 正交試驗結果及分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal test

三種方法測定A和B油樣時的平均誤差分別為11.63%、4.85%、5.27%，可見國標鐵礬顯色法測定低含量甾醇平均誤差較大，Lieberman-Burchard比色法適用于低含量甾醇的測定；三種方法測定C和D油樣時的平均誤差分別為4.54%、9.00%、4.82%，國標鐵礬顯色法測定高含量甾醇的平均相對誤差較小，國標鐵礬顯色法適用于酯交換植物油中高含量甾醇的測定。按照國標法對植物油進行皂化，對于高含量甾醇酯交換植物油可稀釋后測定，最佳稀釋倍數為10倍，顯色穩定后，在15 min測定吸光值。

2.8 國標鐵礬顯色法回收率試驗

采用加樣回收法。取同批酯交換植物油樣品5份約2.2 mg，精密量取濃度為5.0 mg·mL-1甾醇對照品溶液2 mL，分別加入上述5份樣品中。按國標鐵礬顯色法處理，加2 mL顯色劑，于最大吸收波長處測定吸光度，計算回收率（見表5）。

表4 三種測定方法的比較分析Table 4 Comparative analysis of three methods （%）

表5 回收率測定結果Table 5 Result of fortified recoveries

從表5可見，平均回收率為98.61%，相對標準偏差為0.57%，表明加樣回收可滿足要求，本方法測定結果準確可靠。

3 討論

a.高含量甾醇的酯交換植物油在油脂領域引起了高度重視和關注，具有降血脂、防治心血管疾病的功能。本研究嘗試將測定膽固醇的國標方法，用來測定酯交換植物油中甾醇的含量，甾醇結構上與膽固醇非常相似，兩者產生顏色反應的顯色基團是相同的，以往甾醇的研究方法多由測定膽固醇的方法衍生來。

b.影響顯色反應的因素有稀釋倍數、顯色時間、顯色劑用量、顯色劑的組成比例，其中顯色劑的組成為鐵礬儲備液和濃硫酸，經過正交實驗結果分析得出的最佳顯色劑的組成比例為1∶9，其中濃硫酸濃度較高，在實際操作中需注意。

c.參考不同物質中甾醇含量的檢測方法，在國標鐵礬顯色法基礎上改進后建立了一種新的快速、準確的檢測方法，適用于酯交換植物油中高含量甾醇的檢測，并且與另外兩種檢測方法進行了對比分析，分析結果顯示此方法具有較好精確度和回收率，不需昂貴的標準品，操作簡便快捷，適用于實際研究和產業生產監測，是一種值得推廣的檢測方法。

4 結論

以高含量甾醇的酯交換植物油為檢測對象，探索了國標鐵礬顯色法、Lieberman-Burchard比色法和毛地黃皂甙法測定酯交換植物油中高含量甾醇的可行性，研究結果證明Lieberman-Burchard比色法適用于低含量甾醇的植物油的測定。

通過對國標鐵礬顯色法（食品中膽固醇測定法）的研究，在此基礎上改進后，可適用于酯交換植物油中高含量甾醇的測定。通過正交試驗得出國標鐵礬顯色法最佳顯色條件：顯色劑用量2 mL，顯色劑組成比例1∶9，顯色時間15 min，并試驗得出最佳稀釋倍數為10倍，平均誤差為4.54%，平均回收率為98.61%。具有較好的精度、準確性和回收率，操作方法簡便，為酯交換植物油中甾醇含量的測定提供了一種快速而有效的方法。該方法可為添加甾醇功能性油脂的研究提供參考，并可為產業化生產提供快捷和簡便的監測手段。

[1] Weber N.Cholesterol-lowering food additives:lipase-catalysed preparation of phytosterol and phytostanol esters[J].Food Research International,2002,35(1):177-181.

[2] Nashed B,Yeganeh B,Hayglass K T,et al.Antiatherogenic effects ofdietary plantsterolsare associated with inhibition of proinflammatory cytokine production in Apo E-KO mice[J].J Nutr,2005,135:2438-2444.

[3] Villeneuve P,Turon F,Caro Y,et al.L ipase-catalyzed synthesis of canola phytosterols oleate esters as cholesterol lowering agents[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2005,37(1):150-155.

[4] 賀亮,李銳,鄧旭明.極度高甘油三脂高膽固醇血癥動物模型的建立[J].東北農業大學學報,2009,40(2):79-82.

[5] 韓軍花,楊月欣.植物甾醇的性質、功能及應用[J].國外醫學衛生學分冊,2001,28:285-291.

[6] 文鏡,樊蓉.植物甾醇和植物甾烷醇降膽固醇的功效和安全性[J].食品科學,2005,26(8):437-442.

[7] 陳茂彬,黃琴,吳謀成.植物甾醇油酸酯產品的合成工藝研究[J].中國油脂.2005,30(6):63-65.

[8] 高瑜瑩,裘愛泳,潘秋琴,等.植物甾醇的分析方法[J].中國油脂,2001,26(1):25-28.

[9] 吳時敏,吳某成,付志高.兩種測定植物甾醇總含量的方法初探[J].中國糧油學報,2003,18(6):86-88.

[10] 吳時敏.功能性油脂[M].北京:中國輕工業出版社,2001:180-181.

[11] 中國預防醫學院營養與食品衛生研究所.GB/T 5009.128-2003食品中膽固醇的測定[S].北京：中國標準出版社,2003.

[12] 劉蕾,陳星,李曉麗,等.分光光度法測定大豆總甾醇含量的研究[J].中國油脂,2005,30(4):45-47.

[13] 周寶蘭.米糠油甾醇組成的研究[J].中國糧油學報,1990,5(1):28-35.