微生物發酵法生產納豆工藝條件的優化研究

劉 晶，李紅玲，王 妍，江連洲，于殿宇

（東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

納豆是由大豆經納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發酵而成的一種發酵豆制品。納豆最早起源于中國[1－2]，后來傳入日本。納豆在日本盛行一千多年，并形成了豐富的納豆文化。日本民間有：“納豆頓頓有，活到九十九”的口頭禪[3]。大豆發酵成納豆后，大豆蛋白質經微生物酶的作用轉化成可溶性的多肽和氨基酸，有利于人體吸收[4]。納豆芽孢桿菌是納豆生產中最重要的因素，也是納豆中最重要的有效成分。經納豆芽孢桿菌在通過吞噬大豆蛋白來繁殖的時候，可以產生出無數酵素和維生素，并可在納豆的周圍產生多聚谷氨酸和多聚果糖的混合性粘性物質[5]，具有神奇的功效。納豆芽孢桿菌具有溶血栓、降血壓、抗腫瘤、抗菌、防止骨質疏松等功能[6]。發酵成熟后的納豆含有大量的納豆芽孢桿菌，故具有溶血栓、抗腫瘤、降血壓、血脂及預防動脈粥樣硬化、抗氧化、抑菌等多種功能[7]。

現在世界各國的發酵工業都比較發達,發酵產物的提取工藝也比較完善。而微生物的生長速度快，生長條件易于控制，因而可以通過人工控制發酵條件來獲得大量的目的產物。因此，對由微生物所產的各種發酵產物的研究將有廣闊的發展前景[8]。

傳統的納豆發酵工藝流程為精選大豆→流水浸泡（14 h）→蒸煮（130℃）→接種發酵（24 h）→成熟（5℃下40℃95%濕度10 h；38℃85%濕度11 h）納豆的生產在日本已有上千年的歷史，因此工藝十分成熟，隨著科學技術的進步及對納豆所含功能性成分的探討，在生產納豆方面又有新的發展[9]。

本試驗利用微生物發酵的方法，將提取出的納豆芽孢桿菌接種到蒸煮的大豆中，進而對納豆生產的工藝條件進行優化研究，以期得到較好納豆生產工藝，并以此工藝條件為基礎進行納豆的實際生產，達到提高產量、縮短生產周期，降低成本的目的，并使產品具有營養價值高、風味獨特、價格低廉的特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

非轉基因大豆，市售（含水量14.2%，蛋白質含量約50%）；納豆，哈爾濱日尚食品有限公司。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、水等所用試劑均為分析純，菌株由本實驗室分離篩選保藏菌株。

1.1.2 培養基

納豆芽孢桿菌固體/斜面培養基：牛肉膏0.6 g，蛋白胨2.0 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂3.0 g，水200 mL。

1.1.3 試驗設備

YXQ-280MD型手提式壓力蒸汽消毒器（哈爾濱松花江醫療器械廠）；HZQ-X100A型恒溫搖床（上海一恒科學儀器有限公司）；PB602-N型電子分析天平（梅特勒一托利多儀器上海有限公司）；SWCJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司制造）。

1.2 方法

1.2.1 試驗流程

挑選市售非轉基因、顆粒飽滿、無蟲咬無霉爛、整粒大無畸形、色澤淡黃的大豆，清水沖洗，直至無雜物，豆水比1∶3浸泡12 h后，分裝入三角瓶放在高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮30 min，隨即取出放入無菌操作臺內進行冷卻。將從納豆中提取、分離得到納豆芽孢桿菌（實驗室提供）接種到冷卻的蒸煮大豆中，放入恒溫震蕩培養箱中，在一定溫度下進行不同時間的恒溫震蕩培養后，將三角瓶放在4℃下后熟。

1.2.2 納豆的感官評價

納豆的感官鑒定標準如表1所示[10]。參與感官評定的人員為東北農業大學食品學院在校學生28人，首先，對哈爾濱日尚食品有限公司的納豆進行感官評價，隨后對本試驗所產的納豆進行感官評價。

表1 納豆的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of natto

1.2.3 納豆中主要成分測定

納豆中水分采用蒸餾法測定樣品中水分含量[11]；采用凱氏定氮法測定納豆中蛋白質含量[12]。納豆中粘多糖的測定參照文獻[13]。

納豆中的粘液是由粘多糖組成的，所以測得納豆的粘液率即為納豆中粘多糖的含量。準確稱取5.0000 g納豆，一式2份，一份直接在105℃烘箱中烘至恒重W1，另一份用溫水輕輕地洗掉納豆表面的粘液，再將納豆移入烘箱中烘至恒重W2，所得數據即為粘液產率（X），重復3次取平均值，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對納豆感官的影響

接種了納豆芽孢桿菌的大豆分別在31～39℃下發酵24 h，后熟時間為24 h對發酵后的納豆進行感官評定，評定結果如表2所示。

從表2中可以看出納豆芽孢桿菌的最適發酵溫度為35℃。當發酵溫度過低或過高時會影響納豆芽孢桿菌生長，導致菌種的生長速度會降低，合成粘性物質所需的多種胞外酶產量降低，納豆的透明度差、黏度小，從而影響了粘性物質的合成和納豆風味物質的形成，而造成納豆的拉絲性降低風味差。

表2 發酵溫度對納豆感官的影響Table 2 Effect of fermentation temperature on the sensory quality of natto

2.2 發酵時間對納豆的影響

接種了納豆芽孢桿菌的大豆分別在35℃下發酵18～42 h，后熟時間為24 h，對發酵后的納豆進行感官評定，評定結果如表3所示。

由表3可知，納豆芽孢桿菌的最佳發酵時間為24 h。隨發酵時間的延長，納豆的氣味逐漸形成，納豆特有的香氣產生，但當發酵時間過高，納豆的味道變得過于濃厚，嚴重影響納豆的味道。

表3 發酵時間對納豆感官的影響Table 3 Effect of fermentation time on the sensory quality of natto

2.3 后熟時間對納豆的影響

接種了納豆芽孢桿菌的大豆分別在35℃下發酵24 h后，經過18～36 h的后熟后，對發酵后的納豆進行感官評定，評定結果如表4所示。

由表4可知，最佳后熟時間為24 h。該試驗隨著后熟時間的升高，納豆由最初的淡黃色變成金黃色，而且有光澤，但當溫度過高，納豆的色澤開始逐漸變成暗褐色。

2.4 正交試驗

選用L9（33）正交表進行納豆生產工藝的正交試驗，確定最佳發酵溫度、發酵時間和后熟時間等反應條件，以得到感官質量好的納豆。

分別對以上三個因素的幾種水平對工藝效果影響進一步分析：

發酵溫度：生產納豆的發酵溫度為35℃時納豆的拉絲性最好、不易斷，因此發酵溫度35℃為最優水平；發酵時間：生產納豆的發酵時間在24 h時，有濃重的納豆香味，即此條件為最優水平，所以選擇發酵時間為24 h；后熟時間：納豆的后熟時間在24 h的條件下，納豆的顏色呈金黃色并帶有色澤，后熟時間為24 h時是本條件的最優水平。

結果見表5，6。

表4 后熟時間對納豆感官的影響Table 4 Effect ripened time on the sensory quality of natto

表5 納豆工藝正交試驗因素水平Table 5 Factors natto process level orthogonal test table

表6 正交試驗因素水平Table 6 The level of orthogonal test

綜上所述，通過正交試驗見表6，可以得出發酵時間＞發酵溫度＞后熟時間，由R值可知，發酵時間和發酵溫度對納豆的生產影響較大，其次是后熟時間。選擇最優試驗條件為A2B1C1，從試驗組看出應選擇A2B1C2。

做兩組發酵溫度為35℃、發酵時間24 h、后熟時間分別為18和24 h時，對兩組納豆感官進行評價，最終得出發酵溫度為35℃、發酵時間24 h、后熟時間24 h是最佳工藝條件。

3 討論

為以后納豆的工業化生產提供了一定的基礎。2003年納豆在日本方興未艾，每年以大于10%的速度急劇增長，年產、消費納豆近20萬t，銷售額已近2 000億日圓。而且，在香港地區、韓國和美國，納豆也得到不少人的喜愛。本試驗所確定的工藝參數與傳統的直接接入納豆芽孢桿菌生產納豆的方法來比，采用微生物提取法所確定的工藝參數來作為生產參數，水分、蛋白質及粘多糖含量均較傳統工藝提高，所生產出的納豆口味最佳。本試驗在生產工藝上更加具體化了納豆的生產條件，使納豆的品質（感官品質和成分含量）明顯提高。相信在我國，隨著人口的不斷老化和人們對納豆的營養和保健功能的認識，具有多種保健功能的納豆的開發前景必將十分廣闊。納豆在我國的發展前景甚好，對我國傳統食品要進一步的改進和開發起到了一定的促進作用，事實上我國傳統食品豆豉在生產原料，生產用菌、生產工藝都與納豆有相似之處，經科學家試驗證明，豆豉的營養幾乎與牛肉相當，并含有大量能溶解血檢的晝夜激素，能有效地預防腦血檢的形成，對改善大腦的血流量和防治老年性癡呆癥等作用。現今我們應大力發展和開發我國傳統食品，更進一步的完善食品行業。

4 結論

本試驗通過對納豆生產工藝影響因素發酵時間、發酵溫度、后熟時間的研究確定納豆的最佳工藝條件為：發酵時間24 h，發酵溫度35℃，后熟時間24 h。采用此工藝參數生產出的納豆水分、蛋白質及粘多糖含量分別為61.8%、19.34%和5.08%。而市售納豆中的水分、蛋白質及粘多糖含量分別占納豆總量的60.4%、19.26%和4.18%，可見，納豆的水分、蛋白質及粘多糖含量較傳統的發酵方法分別提高了1.4%、0.08%和0.9%，此時的納豆口味最佳。

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