反相高效液相色譜法測定醋酸甲萘氫醌片的含量＊

林 昀，龔士學，程輝躍

（重慶市藥品檢驗所，重慶 401121）

醋酸甲萘氫醌又名維生素K4，是維生素類藥，主要適用于腸道吸收不良及各種原因所致阻塞性黃疸、慢性潰瘍性結腸炎等腸道吸收功能減低等造成維生素K缺乏的凝血障礙性疾病。現行標準中，醋酸甲萘氫醌片的含量測定方法為紫外分光光度法[1－3]。筆者按質量標準方法驗證指導原則[1]，建立了測定醋酸甲萘氫醌片含量的反相高效液相色譜法，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器和二極管陣列檢測器）；AgilentC18柱（250mm×4.6mm，5μm），AichromBond－AQC18柱（250mm×4.6mm，5μm），WelchMaterialsC18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；AE 240型電子天平（瑞士梅特勒）。醋酸甲萘氫醌對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為0228－9802）；樣品（3個廠家共6批，均為市售品）；乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 測定波長選擇

取醋酸甲萘氫醌對照品約10 mg，用適量流動相溶解并稀釋成每1 mL中含0.02 mg的溶液，照紫外－可見分光光度法[2005年版《中國藥典（二部）》附錄ⅣA]，在230～400 nm波長范圍內掃描（圖1）。結果285 nm波長處有最大吸收，故以此為測定波長。

圖1 醋酸甲萘氫醌紫外掃描圖譜

2.1.2 流動相選擇

由于國內外藥典均未收載該品種的高效液相測定方法。筆者經考察和篩選，最終決定以乙腈－水（65∶35）為流動相，柱溫為室溫，檢測波長285 nm，流速1.0mL/min，進樣量20μL。在此色譜條件下，被測物質峰與相鄰雜質峰分離度良好，保留時間適中，峰純度因子為999.0，色譜圖見圖2 C。

圖2 高效液相色譜圖

2.1.3 空白輔料影響及破壞性試驗

稱取按處方量配制的空白輔料（相當于1片的量），加流動相約100mL，置37℃水浴中，超聲處理10min，放冷，濾過，作為空白輔料溶液。取該續濾液按上述色譜條件測定，結果見圖2 B。另取本品細粉適量（約相當于醋酸甲萘氫醌20mg），分別經堿破壞、酸破壞、氧化破壞、光照破壞及熱破壞后用流動相稀釋成質量濃度為0.02 g/L的溶液，照上述色譜條件進樣分析，在3倍主峰保留時間內，未見破壞試驗產生的各雜質峰，證明本實驗色譜條件可行。

2.2 溶液制備

精密稱取樣品（批號為080201）20片，研磨后取6份（每份相當于醋酸甲萘氫醌10mg），分別置50mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取醋酸甲萘氫醌對照品適量，同法配制成對照品溶液。

2.3 系統耐用性試驗

分別用 Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Aichrom-Bond－AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Welch Materials C18柱（150mm×4.6mm，5μm）3種色譜柱按上述條件試驗，結果基本一致，說明本方法的耐用性較好。可見，輔料在醋酸甲萘氫醌峰的保留時間處無干擾，對測定無影響。

2.4 方法學考察

線性范圍考察與定量限確定：精密稱取醋酸甲萘氫醌對照品39.71mg，置100mL量瓶中，用適量流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0，2.5，5.0，10.0，15.0mL，分別置100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為4.0，10.0，20.0，40.0，60.0μg/mL的對照品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，以質量濃度 X對峰面積 Y進行回歸，得回歸方程 Y=27 001X+2.943 7，r=1.000（n=5）。結果表明，醋酸甲萘氫醌質量濃度在 4.0～60.0μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。以 S/N=10計算，本品的定量限確定為54.21 ng/mL。

精密度試驗：取質量濃度為20.0μg/mL的對照品溶液，照上述色譜條件進樣分析，連續5次，記錄色譜圖。結果峰面積的 RSD為0.04％（n=5）。

穩定性試驗：取質量濃度為20.0μg/mL的供試品溶液，分別在0，1，2，4，6h時測定。結果峰面積的 RSD為0.21％（n=5），表明醋酸甲萘氫醌溶液在室溫下6h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品，照上述色譜條件依法測定。結果醋酸甲萘氫醌片的平均含量為98.79％，RSD為0.91％（n=6），表明方法重復性良好。

回收率試驗：分別取對照品約16，20，24 mg各3份，精密稱定，分別置50mL量瓶中，加入相應輔料，用流動相適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為對照品溶液。精密量取續濾液5.0mL，置100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液和對照品溶液各20μL，依法測定，計算回收率。結果見表1。

表1 醋酸甲萘氫醌回收率試驗結果（n=9）

2.5 樣品含量測定

取3個廠家共6批樣品各2份，按本試驗所用方法與2005年版藥典方法分別測定含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

現行質量標準中的紫外分光光度法專屬性不強，易受溶劑和輔料的影響。雖有人采用高效液相色譜法測定含量[4]，但測定波長接近末端吸收，在200～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，醋酸甲萘氫醌在末端比雜質有更大的吸收，影響其他雜質的檢測，而在285 nm波長處各雜質峰均有不同程度的吸收，利于主成分的含量測定，故將檢測波長定在285 nm。

在流動相選擇過程中，乙腈的量過少時，分析時間較長，且峰形不好，當乙腈∶水（65∶35）時，主峰與各雜質峰能很好分離，分離度大于1.5，且峰形良好。

由含量測定結果可以看出，兩種方法的測定結果差異不大。但用高效液相色譜法可以有效地將主成分與雜質分開，該方法專屬性強、靈敏度高、重復性好、操作簡便、結果準確可靠，適用于醋酸甲萘氫醌制劑的質量控制。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業出版社，2005：840，附錄172－173.

[2]顧弟元，陳佩綿.紫外分光光度法測定維生素Kd片劑含量方法的改進[J].蘇州醫學院學報，1995，15（2）：372－373.

[3]郭金鵬，王英英.分光光度法測定片劑中維生素K4的含量[J].河北醫學學院學報，1989，10（3）：157－158.

[4]陳建琴，鄭 潔.高效液相色譜法測定醋酸甲萘氫醌片的含量[J].中國醫院藥學雜志，2005，25（4）：376－377.