正交試驗優選獨一味總黃酮的提取工藝

王 超，王 永，宋 劍，李云鵬，秦 攏，王 猛，安軍永

（石家莊以嶺藥業股份有限公司，河北 石家莊 050035）

獨一味系藏族習用藥材，為唇形科植物獨一味的干燥地上部分，性甘、苦、平，歸肝經，具有活血止血、祛風止痛等功效，用于跌打損傷、外傷出血、風濕痹痛、黃水病等癥。獨一味主要分布在甘肅甘南、四川若爾蓋、西藏林芝等藏區[1]，藏語稱為“大巴”“打布巴”，最早載于《四部醫典》《月王醫診》等藏醫名著[2]。其主要化學成分為黃酮類、苷類、揮發油類和其他類成分[3]，其中黃酮為其主要成分。筆者采用乙醇為提取溶劑，用 L9（3）4正交設計，以總黃酮含量、山梔苷、甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量以及出膏率為指標，優選獨一味藥材的提取條件，為其總黃酮的分離純化工藝提供試驗依據，現報道如下。

1 儀器與材料

98－1－B型電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；S－FCJ－03型電熱鼓風干燥箱（江蘇海門縣試驗儀器廠）；FW 177型中草藥粉碎機（天津市索斯特儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；SHZ－D型循環水真空泵（河南鄭州長城科工貿有限公司）；HH.S11－2型電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；UV－2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；Agilent1100 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sartorius BS 110型電子天平。獨一味藥材購自河北安國以嶺飲片有限公司（產地為甘肅，批號為100301），經本公司田清存高級工程師鑒定，與2010年版《中國藥典（一部）》正品相符；山梔苷甲酯對照品（批號為111873－201001），8－O－乙酰山梔苷甲酯對照品（批號為111872－201001），蘆丁（批號為100080－200707）均購自中國食品藥品檢定研究院；95％乙醇（藥用規格）；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 總黃酮含量測定（紫外分光光度法）

2.1.1 溶液制備

取蘆丁對照品10 mg，用P2O5真空干燥器干燥24h，精密稱定，置50mL容量瓶中，加70％乙醇至刻度搖勻，即得質量濃度為0.2 g/L的對照品溶液。精密量取提取液2.5mL，加入5％亞硝酸鈉10mL，搖勻，放置6min；加入10％硝酸鋁10mL，搖勻，放置6min；加入4％氫氧化鈉100mL，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2 方法學考察

標準曲線制備：精密吸取一定量對照品溶液1，2，3，4，5，6mL，分別置25mL量瓶中，各加蒸餾水至6mL，按供試品溶液制備方法處理，放置15min，在500 nm波長處測光度，以吸光度為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪標準曲線，得回歸方程 Y=16.643X+0.074。r=0.993 7（n=6）。結果表明，蘆丁質量濃度在8～48μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

穩定性考察：選取某一質量濃度的供試品溶液，按上述條件測定吸光度，間隔2h測定1次。結果 RSD=0.88％，表明供試品溶液24h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品，依法制備供試品溶液并連續測定5次。結果的 RSD=1.08％，表明方法重復性良好。

回收率試驗：取已知含量的獨一味總黃酮提取物，精密稱定，加入小檗堿對照品適量，制備供試品溶液，測定吸光度。計算得平均加樣回收率為98.7％，RSD為2.25％（n=9）。

2.2 山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量測定[4]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：VP－ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；檢測波長：235 nm；流速：1.0mL/min；流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫（見表1）。

2.2.2 對照品溶液制備

表1 流動相梯度洗脫表

取山梔苷甲酯對照品、8－O－乙酰山梔苷甲酯對照品各15mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，作為貯備液，吸取10mL，置50mL量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為30μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

標準曲線制備：精密吸取一定量對照品貯備液，用甲醇配制成質量濃度為5，20，30，40，60μg/mL的混合對照品溶液，精密吸取10μL注入高效液相色譜儀中，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程山梔苷甲酯 Y=4 179.9 X－112.59（r=0.999 3），8－O－乙酰山梔苷甲酯 Y=1 673.7 X－11.547（r=0.999 5）。結果表明，山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯對照品質量濃度在5～60μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

穩定性試驗：選取某一質量濃度的供試品溶液，按擬訂條件測定含量，間隔2h測定1次。結果供試品溶液在24h內穩定，山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯的 RSD分別為0.52％和0.81％。

重復性試驗：取同一供試品溶液連續測定5次。結果山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯的 RSD分別為0.32％和0.55％，表明方法重復性良好。

回收率試驗：取已知含量的獨一味藥材提取液，精密稱定，加入山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯混合對照品適量，制備供試品溶液，測定含量。計算平均加樣回收率分別為98.7％和98.2％，RSD分別為1.25％和1.31％（n=6）。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 提取溶劑考察

稱取4份獨一味藥材，每份30 g，分別加入10倍量的不同體積分數的乙醇為提取溶劑，提取2次、每次2h，提取液定容于1 000mL量瓶中，精密量取提取液25mL到100mL量瓶中，以總黃酮含量、山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量以及出膏率為指標考察，結果見表2。可見，乙醇體積分數越高，指標性成分含量越高，但是出膏率隨著醇濃度的提高而降低，而用70％乙醇和80％乙醇作為溶劑提取對含量影響較小，且70％乙醇提取的出膏率較高。綜合考慮，選擇70％乙醇作為藥材的提取溶劑。

表2 提取溶劑考察結果

2.3.2 正交試驗方法

選取對藥材提取影響較大的提取次數（因素A）、提取時間（因素B）、加醇量（因素C）進行考察，將藥材粉碎成粗粉，按 L9（34）表進行試驗，每份樣品的稱樣量為30 g，提取液定容于1 000mL量瓶中，精密量取提取液25mL到100mL量瓶中，分別以總黃酮、山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯為含量指標，以出膏率為指標考察。因素水平表見表3，各指標成分的正交試驗結果及方差分析結果見表4至表9。可見，對本試驗結果影響較大的因素為，提取次數＞提取時間＞加醇量，選擇的因素中只有提取次數對3個考察指標有顯著性影響，其他因素影響較小，因此確定本藥材的最佳提取工藝為A3B3C3。由直觀分析表可知，提取2h和1.5h以及加10倍量和12倍量溶劑對本試驗的影響較小，因此選擇優選工藝為A3B2C2。

表3 因素水平表

表4 山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量直觀分析表

表5 山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量方差分析表

表6 總黃酮直觀分析表

表7 總黃酮方差分析表

表8 出膏率直觀分析表

表9 出膏率方差分析表

2.3.3 驗證試驗

稱取兩組獨一味藥材，每組3份，每份30 g，一組按照最佳工藝A3B3C3進行提取，一組按照優選工藝提取，提取液分別定容于1 000 mL容量瓶中，精密量取提取液25 mL到100 mL容量瓶中，用70％乙醇定容至刻度，以總黃酮含量、山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量以及出膏率為指標考察，結果見表10。可知，最佳工藝結果為：平均山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量每30 g藥材含191.1mg，平均總黃酮含量為每30 g藥材含1 804.6 mg，平均出膏率為28.1％。優選工藝結果為：平均山梔苷甲酯+8－O－乙酰山梔苷甲酯含量為每30 g藥材含187.1 mg，平均總黃酮含量每30 g藥材1 789.7mg，平均出膏率為27.3％。通過兩個不同工藝的相關指標對比發現，試驗結果相差不大，但考慮到優選工藝省時省工，可降低生產成本，故選擇優選工藝A3B2C2（即加10倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h）為獨一味藥材的提取工藝。

表10 驗證試驗結果

2.4 3批中試試驗

稱取獨一味藥材3份，每份3 000 g，分別按照確定的提取工藝進行提取，樣品定容稀釋到合適的質量濃度，以總黃酮含量、山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯含量和出膏率為指標考察。結果見表11。可知獨一味藥材提取工藝穩定可行。因此，確定提取工藝為加70％乙醇10倍量，提取3次，每次1.5h。

表11 3批中試考察結果

3 討論

通過正交試驗，確定獨一味藥材總黃酮提取的優選工藝為A3B2C2，即加10倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h和最佳工藝為A3B3C3，即加12倍量70％乙醇，提取3次，每次2h。通過驗證試驗進行對比發現，試驗結果相差不大，綜合考慮確定獨一味藥材的提取工藝為A3B2C2，通過3批放大中試試驗，結果表明本提取工藝穩定可行。

獨一味的有效成分和指標性成分為山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯。在考察總黃酮提取工藝時，考慮到采用山梔苷甲酯和8－O－乙酰山梔苷甲酯作為指標性成分考察的試驗結果不夠全面，因此采用總黃酮含量和出膏率為指標進行提取工藝研究。用以上3個指標作為獨一味藥材總黃酮提取工藝條件，較全面地篩選出了獨一味總黃酮的提取工藝，可為獨一味藥材資源的有效使用提供參考。

[1]羅達尚.中華藏本草[M].北京：民族出版社，1997：274.

[2]孟保華，孟憲麗.藏藥獨一味藥理作用研究進展[J].中國藥房，2009，20（3）：232.

[3]梁重棟.藏藥獨一味的基礎與臨床研究[J].蘭州醫學院學報，1987，40（2）：47.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：285－286.