反相高效液相色譜法測(cè)定佐芬普利鈣原料的有關(guān)物質(zhì)

吳亞利，毛士龍，苗積康，季愛玲，朱建民

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031)

佐芬普利鈣為首個(gè)含巰基的第3代長(zhǎng)效血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，用于治療輕至中度原發(fā)性高血壓，以及急性心肌梗死24 h內(nèi)有或無癥狀、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定并未接受溶栓治療的患者。佐芬普利于1998年在英國(guó)被批準(zhǔn)用于高血壓，2001年1月8日在意大利等多個(gè)國(guó)家上市，上市劑型有片劑、膠囊劑，規(guī)格有7.5 mg和15mg[1－2]。該原料藥有關(guān)物質(zhì)分析方法的研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，筆者建立了反相高效液相色譜法測(cè)定佐芬普利鈣的有關(guān)物質(zhì)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型液相色譜儀，包括G1311A四元泵、DAD監(jiān)測(cè)器、Agilent1100 ChemStation)；Mettler AB25S型分析天平，Shimadzu UV－2550型紫外分光光度計(jì)。佐芬普利鈣原料(批號(hào)分別為090501，090502，090503，含量分別為99.23%，99.67%，99.78%)和中間體1－8(批號(hào)分別為ZG－05161，ZG－05162，ZG－05163， ZG－05164，ZG－05165，ZG－05166，ZG－05167，ZG－05168，純度分別為95.35%，94.95%，97.12%，95.25%，98.06%，98.17%，97.91%，98.84%)均由上海道尼醫(yī)藥科技有限公司提供；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[3]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇－水－冰醋酸(76∶24∶1)；柱溫：40℃；流速：1mL/min。在此條件下考察各中間體的分離情況。分別稱取中間體1－7(中間體8遇水分解，不穩(wěn)定)適量，用甲醇溶解并稀釋成0.3g/L的中間體溶液，分別量取各中間體溶液0.5mL，置50mL量瓶中，加入佐芬普利鈣約15mg，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合溶液，分別取中間體溶液與混合溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。由圖1可知，各中間體能較好分離，且與主藥分離良好，表明上述色譜條件可用于本品的有關(guān)物質(zhì)檢查。

圖1 各中間體和佐芬普利鈣混合樣品的高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取佐芬普利鈣原料約15 mg，精密稱定，置50mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。另精密量取供試品溶液2mL，置100mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

破壞性試驗(yàn)：精密稱取原藥15 mg，置10 mL具塞試管中，共5份。其中3份分別加0.1mol/L鹽酸2 mL、0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2mL和雙氧水2mL，放置8 h后，將pH調(diào)至7；另外兩份用流動(dòng)相2mL溶解后，分別在100℃水浴上加熱1 h和在5 000 lx照度下光照8 h，最后將各樣品轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，并用流動(dòng)相溶解定容，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(圖2)。結(jié)果表明，本品在光照條件下未被破壞，在其他4種條件下均被破壞，其中堿破壞最嚴(yán)重，但各破壞產(chǎn)物峰與主峰能完全分離，表明擬訂的色譜條件可用于本品的有關(guān)物質(zhì)檢查。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖

線性、校正因子及最小檢測(cè)限試驗(yàn)：精密稱取供試品和中間體1－7各20mg，分別置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，精密量取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分別置100mL量瓶中，用流動(dòng)相定容，進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度 C對(duì)峰面積 A進(jìn)行線性回歸，以各樣品線性方程的斜率計(jì)算各中間體相對(duì)于1的校正因子 f，f=(A中間體1－7/C中間體1－7)/(A原料藥/C原料藥)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，佐芬普利鈣質(zhì)量濃度在1.02～6.12μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以 S/N=3.07計(jì)，佐芬普利鈣的最小檢測(cè)限為0.204 ng。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將配置好的對(duì)照溶液密閉并于室溫下放置，分別于0，3，6，9，12，15 h時(shí)精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，結(jié)果的 RSD=0.67%(n=6)。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 校正因子測(cè)定結(jié)果

精密度試驗(yàn)：取同一批(批號(hào)為090501)佐芬普利鈣，按照擬訂的色譜條件測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，設(shè)定80%，100%和120%3個(gè)取樣量，每個(gè)取樣量測(cè)定3次，共測(cè)定9次，記錄色譜圖。結(jié)果總有關(guān)物質(zhì)色譜峰的 RSD為8.98%，單個(gè)最大雜質(zhì)的 RSD為2.80%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 有關(guān)物質(zhì)檢查

取本品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋成每1 mL約含0.3 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液2mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液20μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為記錄儀滿量程的10%～20%，再取供試品溶液和對(duì)照溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至3倍主峰保留時(shí)間，供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰峰面積之和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5倍(1.0%)，單個(gè)最大雜質(zhì)峰峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.25倍(0.5%)。依法檢查了3批樣品，結(jié)果批號(hào)為090501，090502，090503的3批樣品中，所含總有關(guān)物質(zhì)分別為0.37%，0.45%，0.48%，單個(gè)最大雜質(zhì)分別為0.37%，0.31%，0.33%。

3 討論

有機(jī)原料藥中的雜質(zhì)一般為各步反應(yīng)中間體及可能的降解產(chǎn)物。分別取中間體1－7和佐芬普利鈣的混合溶液20μL，注入液相色譜儀，用二極管陣列檢測(cè)器在180～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄色譜圖。結(jié)果各中間體在180～270 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收，且在220 nm波長(zhǎng)處的吸收均較強(qiáng)，原料藥佐芬普利鈣在220 nm波長(zhǎng)處也具有較強(qiáng)吸收，故參考文獻(xiàn)[3]后，選擇220 nm作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。曾參照文獻(xiàn)[3]，以甲醇－水－磷酸(68∶32∶0.2)為流動(dòng)相，但該流動(dòng)相酸性較強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間分析對(duì)色譜柱影響較大。經(jīng)過多次摸索，最后選定酸性較弱的甲醇－水－冰醋酸(76∶24∶1)作為流動(dòng)相，降低了流動(dòng)相對(duì)色譜柱的破壞性。由于本品批次較少，尚未確定已知雜質(zhì)，且已知雜質(zhì)難以獲得，故暫以主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量。試驗(yàn)結(jié)果表明，反相高效液相色譜法快速簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，分離度好，靈敏度高，可以很好地控制樣品質(zhì)量。

[1]劉 魯，王 菊，仲 英.第三代長(zhǎng)效血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑——佐芬普利鈣[J].齊魯藥事，2005，24(11)：701－702.

[2]傅 毅.降壓藥：佐芬普利[J].世界臨床藥物，2003，24(1)：53－54.

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