IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶在大腸癌中的表達(dá)研究

宋洋 徐正磊 張茹 王立生

大腸癌為結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，是指大腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，預(yù)后不良，死亡率較高。大腸癌是大腸粘膜上皮起源的惡性腫瘤，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。本研究探討IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路在大腸癌中的表達(dá)，希望能夠?yàn)榇竽c癌基因治療的研究發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠共40只，5～6周齡，雌雄各半，由廣州動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。40只小鼠隨機(jī)分為正常組和大腸癌組。細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的二抗購自Dako公司，大腸癌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，羊抗人PI3K多克隆抗體工作液購自Santa cruz 公司，流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大腸癌動(dòng)物模型 在小鼠腹背側(cè)部皮下注射0.2ml含5×106個(gè)人大腸癌細(xì)胞株的懸液, 成瘤后用組織塊套管針法皮下移植為實(shí)體瘤。其中結(jié)腸癌12只，直腸癌8只。

1.2.2 制備單細(xì)胞懸液 取正常組和大腸癌組小鼠的組織，乙醇固定，分別放在不銹鋼網(wǎng)上（120目），下置一平皿。將組織剪碎，用生理鹽水沖洗組織同時(shí)用鑷子輕輕揉搓。用300目的銅網(wǎng)過濾平皿中的懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液。以600r/min離心2min，然后收集細(xì)胞沉淀。

1.2.3 免疫熒光標(biāo)記 取單細(xì)胞懸液1×106/ml個(gè)細(xì)胞，加入0.1 ml羊抗人PI3K多克隆抗體工作液，室溫孵育30min，加入10 ml PBS清洗，離心后棄上清。為除去未結(jié)合的熒光二抗加入100μl羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育30min（避光），加入10 ml PBS清洗后同上離心，棄上清。經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾，加入0.1ml PBS懸浮細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。設(shè)代替一抗和二抗的陰性對(duì)照，以及只加一抗或二抗的陽性對(duì)照，對(duì)蛋白免疫熒光標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定。

1.3 蛋白表達(dá)分析 以熒光指數(shù)（FI）表示, FI=(樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達(dá)，F(xiàn)I＞1.0為陽性表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常組20例正常大腸組織中有5例FI＜1.0，陽性表達(dá)率為75.0%；大腸癌組20例均FI＞1.0，陽性表達(dá)率為100.0%，且FI均比正常組高。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常組平均FI=（1.1±0.3），大腸癌組平均FI=（1.4±0.2），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

近年來，由于人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌發(fā)病率有上升趨勢(shì)。大腸癌惡性度較高，包括結(jié)腸癌和直腸癌。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是抑癌基因失活、癌基因激活所致。近年來的研究在早期診斷、治療方法等方面有了較大進(jìn)展，但大腸癌的五年生存率仍然較低[1]。新的觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞癌變是由于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性異常，刺激細(xì)胞異常增殖所致。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成成員包括許多癌基因和抑癌基因的相關(guān)產(chǎn)物，PI3K是一種與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的脂類第二信使[2]。磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸、磷脂酰肌醇-3,-4,-5-三磷酸(ptdins3,4,5ps,PIP3)作為第二信使發(fā)揮作用，這些脂類主要由磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(ptdins4,5p2.PIP2)和磷酸化磷脂酰肌醇-4-磷酸(ptdins4,PI4P)生成。

增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)均有PI3K信號(hào)參與，IA PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型的改變。各種癌基因酪氨酸激酶受體均能活化PI3K[3]。Akt可通過以下途徑影響大腸癌的生長(zhǎng)：①活化NF-KB，增加抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)；②參與調(diào)節(jié)pRB的磷酸化過程，調(diào)控p27KIPl、cyclinD的表達(dá)和活性；③對(duì)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白BAD和蛋白水解酶Caspase-g直接磷酸化，從而阻止凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的生存。有研究認(rèn)為在人類腫瘤中，PI3K/Akt通路關(guān)鍵分子的編碼基因在DNA水平上存在結(jié)構(gòu)的變化，能引起PI3K的組成性活化和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，大腸癌中p85α基因在iSH2區(qū)域的缺失和突變能導(dǎo)致PI3K的激活[4-5]。而抑制PI3K活性后細(xì)胞的增殖明顯被抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞周期阻滯、G1期相關(guān)蛋白CyclinDl和CDK4表達(dá)量減少以及Rb的磷酸化等，這種細(xì)胞周期的阻滯能因細(xì)胞中活性Akt及其下游分子p70S6K的表達(dá)而恢復(fù)，揭示PI3K至少在這些腫瘤中是原癌基因[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)PI3K蛋白在大腸癌癌變過程中陽性表達(dá)率逐漸升高，提示PI3K蛋白在大腸癌癌變過程中表達(dá)異常。

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