IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶在大腸癌中的表達研究

宋洋 徐正磊 張茹 王立生

大腸癌為結腸癌和直腸癌的總稱，是指大腸粘膜上皮在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生的惡性病變，預后不良，死亡率較高。大腸癌是大腸粘膜上皮起源的惡性腫瘤，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。本研究探討IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路在大腸癌中的表達，希望能夠為大腸癌基因治療的研究發現新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為BALB/c小鼠共40只，5～6周齡，雌雄各半，由廣州動物實驗中心提供。40只小鼠隨機分為正常組和大腸癌組。細胞免疫熒光標記的二抗購自Dako公司，大腸癌細胞株由本實驗室傳代培養，羊抗人PI3K多克隆抗體工作液購自Santa cruz 公司，流式細胞儀購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大腸癌動物模型 在小鼠腹背側部皮下注射0.2ml含5×106個人大腸癌細胞株的懸液, 成瘤后用組織塊套管針法皮下移植為實體瘤。其中結腸癌12只，直腸癌8只。

1.2.2 制備單細胞懸液 取正常組和大腸癌組小鼠的組織，乙醇固定，分別放在不銹鋼網上（120目），下置一平皿。將組織剪碎，用生理鹽水沖洗組織同時用鑷子輕輕揉搓。用300目的銅網過濾平皿中的懸液，去除細胞團塊，收集細胞懸液。以600r/min離心2min，然后收集細胞沉淀。

1.2.3 免疫熒光標記 取單細胞懸液1×106/ml個細胞，加入0.1 ml羊抗人PI3K多克隆抗體工作液，室溫孵育30min，加入10 ml PBS清洗，離心后棄上清。為除去未結合的熒光二抗加入100μl羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育30min（避光），加入10 ml PBS清洗后同上離心，棄上清。經500目銅網過濾，加入0.1ml PBS懸浮細胞后上機檢測。設代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加一抗或二抗的陽性對照，對蛋白免疫熒光標記物進行測定。

1.3 蛋白表達分析 以熒光指數（FI）表示, FI=(樣品蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/正常對照樣品平均熒光強度，FI≤1.0為陰性表達，FI＞1.0為陽性表達。

1.4 數據分析 采用統計軟件SPSS12.0對數據進行處理，兩組計量資料比較采用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

正常組20例正常大腸組織中有5例FI＜1.0，陽性表達率為75.0%；大腸癌組20例均FI＞1.0，陽性表達率為100.0%，且FI均比正常組高。兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。正常組平均FI=（1.1±0.3），大腸癌組平均FI=（1.4±0.2），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

近年來，由于人們膳食結構的改變，大腸癌發病率有上升趨勢。大腸癌惡性度較高，包括結腸癌和直腸癌。傳統的觀點認為，腫瘤的發生是抑癌基因失活、癌基因激活所致。近年來的研究在早期診斷、治療方法等方面有了較大進展，但大腸癌的五年生存率仍然較低[1]。新的觀點認為細胞癌變是由于信號轉導途徑的活性異常，刺激細胞異常增殖所致。近年來的研究發現，細胞生長、增殖、分化等信號轉導途徑的組成成員包括許多癌基因和抑癌基因的相關產物，PI3K是一種與細胞內信號傳導有關的脂類第二信使[2]。磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸、磷脂酰肌醇-3,-4,-5-三磷酸(ptdins3,4,5ps,PIP3)作為第二信使發揮作用，這些脂類主要由磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(ptdins4,5p2.PIP2)和磷酸化磷脂酰肌醇-4-磷酸(ptdins4,PI4P)生成。

增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節均有PI3K信號參與，IA PI3K/Akt信號通路在腫瘤發生、發展過程中的作用主要表現在促進細胞轉化表型的改變。各種癌基因酪氨酸激酶受體均能活化PI3K[3]。Akt可通過以下途徑影響大腸癌的生長：①活化NF-KB，增加抑凋亡基因bcl-2的表達；②參與調節pRB的磷酸化過程，調控p27KIPl、cyclinD的表達和活性；③對凋亡級聯反應的調節蛋白BAD和蛋白水解酶Caspase-g直接磷酸化，從而阻止凋亡，促進細胞的生存。有研究認為在人類腫瘤中，PI3K/Akt通路關鍵分子的編碼基因在DNA水平上存在結構的變化，能引起PI3K的組成性活化和細胞轉化，大腸癌中p85α基因在iSH2區域的缺失和突變能導致PI3K的激活[4-5]。而抑制PI3K活性后細胞的增殖明顯被抑制，表現為細胞周期阻滯、G1期相關蛋白CyclinDl和CDK4表達量減少以及Rb的磷酸化等，這種細胞周期的阻滯能因細胞中活性Akt及其下游分子p70S6K的表達而恢復，揭示PI3K至少在這些腫瘤中是原癌基因[6]。

本研究發現PI3K蛋白在大腸癌癌變過程中陽性表達率逐漸升高，提示PI3K蛋白在大腸癌癌變過程中表達異常。

[1]孫嫣，田華，肖法 ，等.PI3K p85α在大腸癌癌變過程中的表達及意義[J].南方醫科大學學報,2009,29(3)：416-418.

[2]王舟,王學春,趙瑞花,等.FAK PI3K在胃癌中的表達及相關性研究[J].濟寧醫學院學報，2006，29（4）：3-6.

[3]Dong Z, Huang C, Ma WY. PI-3 kinase in signal transduction,cell transformation, and as a target for chemoprevention of cancer[J].Anticancer Res, 2001,19(5A)：3743-3747.

[4]馬豫茜,關婧,倪麗，等.PI3K p110在大腸癌癌變過程中的表達及意義[J].胃腸病學和肝病學雜志,2010,19(12)：1078-1080.

[5]郭運生.大腸癌組織中PI3K、Akt和HGF的表達變化及意義[J].山東醫藥,2010,50(46)：77-78.

[6]黃曉麗,鄭玉霞,廖再波,等.磷脂酰肌醇3 激酶信號傳導通路在潰瘍性結腸炎發病中的作用[J].四川大學學報(醫學版)，2008，39(3)：364-367.