割手密種質資源研究進展

常 丹,鄢家俊,白史且,梁緒振,干友民,李達旭,游明鴻,楊富裕,張蘊薇

（1.四川農業大學動物科技學院草業科學系,四川 雅安 625014；2.四川省草原科學研究院,四川 成都 611731；3.中國農業大學草地研究所,北京 100094）

割手密（Saccharum spontaneum）即甜根子草,又叫細莖野生種,是禾本科蜀黍族甘蔗屬多年生草本植物[1],具有抗逆性強、適應性廣、分蘗多等優良特性[2-4]。它不僅是甘蔗屬野生種質資源中用于甘蔗雜交育種最早、最有價值的種質[5-6],同時也是甘蔗屬中種類最豐富并且具有較高蔗糖含量的野生種[7-10],兼具能源植物和觀賞草類開發的潛力植物,本研究從割手密的生態分布、遺傳多樣性、育種概況等方面對其進行綜述。

1 割手密種質資源的植物學特性和生態分布

多年生草本,具發達橫走的長根狀莖。稈高1～2 m,直徑4～ 8 mm；葉片線形,長30～70 cm,寬4～8 mm,無毛,灰白色,邊緣呈鋸齒狀粗糙；圓錐花序長20～40 cm,花序下有白色柔毛；小穗卵形或長圓形[1]。割手密宿根性好,固土力強,能適應干旱沙地生長,是鞏固河堤的保土植物[11]。在甘蔗屬各個種中,割手密的生態地理分布最為廣泛,幾乎遍及整個熱帶和溫帶地區。它的生態型包括一年生、帶有根狀莖的多年生[12]。割手密的適應性強,分布范圍廣,在我國 18°15′～ 33°20′N,97°～ 122°E,海拔1 ～2 460 m的廣大地區都有分布[13],主要生長于江、河、湖 、溪 、澗 、溝旁 ,以及河灘沙礫 、沼澤、田埂等多水地帶,有較強的耐漬耐澇能力,極少數個體也生長于較干燥的荒坡地上,并出現葉片細窄、中肋發達的抗旱特征,常連片形成單優勢群落[14]。

2 割手密種質資源的遺傳多樣性

2.1 形態學標記及解剖學從形態學或表型性狀來檢測遺傳變異是最直接也是最簡便的辦法。割手密無性系間顯示很寬的形態學變異:有矮而濃密型,葉片幾乎只有中肋而沒有莖的形成；也有高大、直立、寬葉、長節間型。許多類型都具有高度發達的根狀莖,其長達數米,莖多髓甚至中空[12]。潘世明等[15]在福建境內收集了78份割手密無性系進行了性狀觀察,觀察發現福建割手密大概可分為閩西北、閩北和閩東南3種類型。閩西北的割手密植株矮小,莖徑細,節間長度較短,單莖質量輕,錘度高；閩東南的割手密無性系正好相反,植株高大,莖徑較粗,節間較長,錘度偏低；而閩北的割手密居于閩西北和閩東南之間。楊榮仲等[16]對四川境內59份割手密材料進行聚類分析,分為5類,分別是早熟、高錘度一般表現類型,大莖、較高錘度、高生物產量類型,中莖、偏低錘度、遲抽穗、低生物產量類型,小莖、低錘度較早抽穗、低生物產量類型和小莖、低錘度、低生物產量、不抽穗類型。張革民等[17]對廣西和云南共94份割手密材料的主要數量性狀進行了主成分分析與聚類分析,主成分分析表明,割手密7個數量性狀可簡化為3個主成分,即植株因子、莖數因子、糖分因子；聚類分析表明,將94份割手密材料劃分為4大類群:第1類群蔗糖分較高,莖多,植株高,萌芽率高；第2類群綜合表現一般；第3類群植株高、莖較粗,分蘗少；第4類群蔗糖份偏低,植株較矮,莖較小,萌芽率低而分蘗率較高。張革民等[18]對廣西21份高糖割手密無性系的萌芽率、分蘗率、株高、莖徑、單莖質量進行了測定,其變異系數均較大,超過10%。其中萌芽率、分蘗率、小區莖數、單莖質量的變異系數分別為48.75%、62.86%、36.21%和56.04%,其極差超過同一性狀最小值的3倍以上,表明割手密表型性狀變異度較大、變異類型多。齊永文[19]對保育在廣東省甘蔗種質資源庫中的64份割手密材料進行了9個重要農藝性狀的遺傳多樣性評價,結果表明,64份材料在這9個性狀上都表現出了較高的遺傳差異,變異系數介于0.17～0.58,均超過10%,再次說明了割手密形態學變異系數較大。用該9個性狀對64份材料進行聚類分析,所有試驗材料分為3個類群,第1類群的特點是植株生長高大,蔗糖糖分居中,葉子較長、較寬,但是莖數少；第2類的主要特點是糖分、株高都較低,莖數較多；第3類群的特點是大多數性狀上都居于第1、2類之間,但是在糖分、蔗汁糖分等指標上高于第1類和第2類。

國外對不同種質材料割手密的形態學評價鮮有報道,個別文獻報道的是割手密與甘蔗栽培品種的雜交種的性狀擴大利用[20]。Nose等[21]對甘蔗屬野生種的葉子氣孔交換特性進行了研究,結果表明,高光照強度下,割手密‘Tainan'葉子氣孔的二氧化碳交換率明顯高于甘蔗雜種‘NCo310'。所以,‘Tainan'是一個有益的甘蔗育種種質來源,同時還闡述了割手密葉子氣孔的二氧化碳交換率與葉子的氣孔導度、葉綠素含量等緊密相關。

陳嚴平等[22]對云南大學甘蔗資源圃的割手密的莖進行解剖學制片觀察,研究結果表明,割手密的莖均圓形,為髓所充滿,成為實心莖；表皮加厚,有2～3層下皮層,下皮層以內無厚壁細胞,由3～6列基本組織的薄壁細胞將外圍維管束分開,薄壁區域所占比例大,基本組織較發達。割手密的邊緣維管束鞘均呈向心加厚,即靠木質素端有11～18層厚壁細胞,而靠韌皮部端只有2～3層厚壁細胞,且以橢圓方式加厚；與斑茅（Erianthus arundinaceus）圓環加厚的外圍維管束鞘及只在韌皮部端加厚的內部維管束鞘等特征有明顯區別,這對甘蔗屬植物的分類極具參考價值。陳嚴平等[23]觀察了云南省8種甘蔗屬及近緣屬植物葉片下表皮的解剖結構,觀察結果表明,不同重復間,各個種的葉下表皮構造是穩定的,其中割手密葉片下表皮的解剖結構有如下特征:氣孔行數為1～2行,但1行的居多,副衛細胞形狀為半棱形。下表皮分為2個區:一個為覆蓋于維管束上的肋區（或脈區）；另一個為覆蓋于兩維管束之間的肋間區（或脈間區）。肋區鄰接的二側都有一列刺,割手密的刺細胞呈鷹嘴狀,遮蓋整個肋區,割手密肋區硅細胞除成1縱行分布外,還見到成2～3縱行分布的情況,且下表皮有附屬物乳突。從解剖的角度上進一步證明了割手密成為甘蔗育種中最重要的種質資源的可能性。這些解剖特征可作為外部器官形態分類的補充,也可為甘蔗雜交育種提供解剖學依據。

2.2 細胞學標記細胞學標記能明確顯示植物的遺傳多態性,染色體數目類型的不同反映了基因資源的遺傳多樣性。Kuwada[24]最先報道日本的一個割手密無性系為2n=68,此后許多研究者對割手密進行了染色體數的研究。在甘蔗屬中,割手密有著最寬幅度的染色體數,從2n=40至2n=128。潘世明等[15]對在福建省境內搜集到的21份割手密無性系進行染色體分析,體細胞染色體數目（2n）變異很大 ,從 72 到 102 不等 ,有 72、80、84、88、92 、96、102共 7種類型,其中 84、88、92、96、102在國內是首次報道,80、96兩種類型占多數,各占觀察無性系總數的28.57%和23.81%。楊清輝和李富生[25]先后對采自云南省各地的87份割手密及華南地區的75份割手密作了染色體數目的觀察研究,結果發現云南割手密染色體數目（2n）有 60、64、70、80,共 4種類型,而華南地區的割手密染色體數目（2n）有54、60、64 、78、80、94、96,共 7 種類型 。蔡青等[26]對國家甘蔗種質資源圃保存的來自9個省區247份割手密的染色體數目（2n）進行了分析,得到 60、64、70、72、76 、78、80、92、96、104、108,共 11 種不同類型 ,其中104和108兩種類型為首次報道。

印度Coimbatore甘蔗育種場Panje和Babu[27]對分別采自印度、亞洲西部、東南亞和非洲等地的450份割手密無性系作了染色體計數,其染色體數目（2n）分布為 40～128,共有29種類型。此外,Rithidech和Ramirez[28]、Sreenivasan和Jagathesan[29]對割手密分別進行了細胞學研究。

2.3 蛋白質標記目前,割手密的蛋白質標記主要集中在對其進行同工酶分析。同工酶分析廣泛應用于植物的系統進化、群體遺傳結構分析、品種鑒定、基因定位、雜種優勢等方面的研究。近年來,由于DNA分子標記普及,酶電泳的應用大為減少,但研究水平卻在不斷提高,至今該方法仍然是快速調查群體水平變異的最有效方法之一。邱崇力等[30]分析云南割手密128份樣品的酯酶同工酶,共顯示了15條酯酶同工酶酶帶,它們組成45個酶譜類型,說明割手密具有非常豐富的種內變異。成萍和陳西凱[31]對四川省的48個割手密材料,采用垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠電泳進行同工酶分析。在48個材料中,其過氧化物酶譜表現出明顯的差異,反映在A、B區酶帶數或遷移率的不同。根據同工酶的特征,相應劃分為l9個類型,除有6條共有帶外,均各有特異帶,反映了割手密具有豐富的遺傳多樣性。陳能武等[10]對采自四川主要流域的割手密脂酶同工酶分析結果表明,四川割手密酶譜類型豐富,多達18種,說明四川割手密存在多樣性,且類型豐富。特別是隨著采集流域由西向東分布,在各流域材料的酶譜中,具同工酶慢帶或較慢帶（1-4A）的材料比例由高到低逐漸降低,這可能預示著割手密的進化傳播呈一定的規律。王子琳等[32]對49份福建割手密的酯酶同工酶進行測定,結果共呈現8條酶帶,從正極到負極依次為2-14A,有19種酶譜類型,表明福建割手密有較豐富的種內變異。潘世明等[15]用聚丙烯酰胺雙垂直平板電泳法分析了50份福建各地的割手密無性系,結果共呈現8條酰酶同工酶酶帶,19個酶譜類型。

國外關于割手密蛋白質標記方面的研究報道較少,僅見Sucheela Siriwasaree[33]對幾個割手密無性系（2n=64,72,80,88）進行了過氧化物酶同工酶分析,結果表明,各無性系酶帶各不相同,過氧化物酶同工酶系統可以用來作為割手密無性系的識別指南。

2.4DNA分子標記分子標記是傳統遺傳標記的補充與發展,許多以前無法進行的研究目前利用分子標記手段正蓬勃開展。形態標記、細胞學標記和生化標記的所反映的遺傳多態性的分子基礎均是基因組DNA的變異,而DNA分子標記所揭示的遺傳多態性最直接反映基因組DNA間的差異。國內基于分子標記對割手密不同種質材料遺傳多樣性的報道很少,而且采用的分子標記技術也很單一。楊清輝等[34]選用6個隨機引物,對采自我國不同緯度、不同海撥高度的 32份割手密無性系進行了RAPD分析,結果表明,割手密野生種具有豐富的RAPD多態性,供試的32分割手密無性系可劃分為9個類群。張革民等[19]利用27個引物對21份割手密無性系的基因組DNA分別進行RAPD擴增,27個引物共檢測出205個RAPD位點,其中多態性位點159個,多態性位點百分率為74.84%,21份割手密無性系間的等位基因位點的異質性程度較高,表現出較豐富的遺傳多樣性。

國外,Silva等[35]繪制了割手密RFLP連鎖圖并對其染色體組進行了分析,RFLP連鎖圖由16個DNA探針檢測到的216個基因位點構成,分布了44個連鎖群,按照每隔25 cmol的間距至少一個標記的密度,基因組的覆蓋率被估計為 86%,基于RFLP分子標記的檢測數據得出結論,該物種是一個同源多倍體,估計其基因組大小為2 107 cmol。Cordeiro等[36]利用SSR分子標記技術對甘蔗屬植物進行遺傳多樣性分析和聚類分析,6對SSR引物分析了66份不同的材料,產生了187個等位基因,與其他分子標記技術RFLP、RAPD以及AFLP相比,SSR分子標記技術更適合研究甘蔗種屬間的起源與分類。

3 割手密種質資源的抗逆性

3.1 抗寒性我國曾進行過幾次較大規模的甘蔗野生種質資源的搜集,但對野生種質資源的抗寒性鑒定、分析、評價,目前做得尚少。丁燦等[37]研究了來自不同原生地割手密無性系葉片中的游離脯氨酸（Fpro）的含量與低溫的關系,結果表明,冬季割手密葉片中Fpro的含量與其原生長地的海拔、緯度之間呈極顯著的正相關關系,冬季的Fpro含量平均值分別是夏季的11.4和7.7倍,導致Fpro積累的真正原因是低溫。葉片中Fpro含量與其抗寒性關系十分密切的特點,表明它可以作為甘蔗近緣野生種抗寒力鑒定的指標。陳能武等[10]對四川省制糖糖料工業研究所保育的割手密進行了抗寒性和抗旱性鑒定,其中,抗寒性的鑒定結果表明,抗寒性強的材料其成活率可達100%,而抗寒性弱的材料植株側芽完全死亡。全部參試材料的抗寒性呈正態分布,而川88-33,79-l-4,內江44和川79-1-23等材料在幾種鑒定方法中則表現出穩定的抗寒能力,它們的萌芽率高,凍后生長正常,是今后開展甘蔗抗寒育種時可利用的寶貴資源。

3.2 抗旱性陳能武等[10]采用田間自然鑒定的方法對割手密進行抗旱性鑒定,在參試材料中,有6份材料經過干旱處理后植株生長正常,且無明顯的枯、黃葉出現,呈現出較強的抗性。其中最突出的材料是川79-1-15,79-1-17,79-1-21,79-2-20。這些材料一般都是在旱坡、懸崖等地采得,在長期的自然進化過程中對缺水、干旱產生了較強的適應性,在人工栽培和水份控制下其抗性和適應性得以充分發揮。那些抗旱性表現弱的材料植株生長受到抑制,在水分控制條件下生長完全停止,個別植株甚至死亡。許文花和楊清輝[38]以云南農業大學野生甘蔗資源圃內采集到幾個不同無性系的割手密為參試材料,研究水分脅迫對割手密伸長期的抗旱性影響。測定苗期植株的葉面積,質膜透性、含水量、束縛水含量、失水速率等多個指標,結果表明,不同無性系間各指標的耐旱系數不同,利用模糊隸屬函數對割手密抗旱性進行評價表明割手密不同無性系間的抗旱性不同。相關分析表明,割手密不同無性系間的抗旱性與植株葉面積呈顯著負相關。

4 割手密在甘蔗育種中的應用

割手密是甘蔗野生種質中用于甘蔗雜交育種最早、利用最有成效的種質[6-7],具有抗逆性強、適應性廣、多蘗等許多優良特性[2-5]。廣西甘蔗研究所采用甘蔗花粉貯藏技術后,種屬間雜交工作始步入正軌,雜交組合主要是以廣西割手密和云南割手密的組合為主,主要目的是引入本地割手密適應性好、抗性好以及云南割手密的大莖、生勢好的基因。此外,割手密的低溫貯藏性能較好,雜交成功率高,也是該種雜交組合較多的原因之一[39]。我國海南甘蔗育種場,通過種屬間雜交,也獲得一批割手密優良后代,在育種上起到了重要的作用[40]。20世紀初的“甘蔗高貴化育種”就是因為甘蔗屬熱帶種不抗萎縮病,通過與爪哇割手密雜交和回交開展起來的。美國農業部路州荷馬甘蔗試驗站60年代以來開展的基礎雜交育種計劃,已將耐寒性強的割手密野生種耐寒特性基因導入親本材料,選育出CP65-357等大批早熟高糖耐寒性強的品種,不僅在美國路州種植,我國引進后,近年來在湖南、江西表現優異,試種成功[41]。此外,Tai[42]研究了用低溫冷藏法保存商業化品種甘蔗和野生割手密雜交一代的花粉。

5 作為能源植物研究概況

禾本科能源作物是當今兩大類最有前途的生物質能作物之一[43-46]。割手密不僅植株高大,生物產量高,有較高的光合效率和干物質積累能力,因此,按照能源作物應具備的特征[47],割手密具有較高的生物質能轉化潛力。目前已經開展了對割手密作為能源草開發利用為目的的種質資源考察收集工作[48]。王水琦等[43]已從優良的甘蔗栽培品種與特殊優異的割手密遠緣雜交后代中,選出較好的8個品系作為能源蔗進行研究,對高生物量的能源蔗加以開發利用。在光合特性方面,楊生超等[49]已對割手密的光合特性與原生長地的海拔關系進行了研究,研究表明,割手密無性系在光合特性方面隨著原生長地海拔的不同存在豐富的多樣性特征,其光合特性與海拔密切相關。在國外,印度Anuj和Chandel[50]已將割手密作為能源植物用以生產乙醇,通過實驗測得割手密含有（45.10±0.35）%的纖維素和（22.75±0.28）%的半纖維素,并認為割手密生長速度快,經濟投入少,是生產乙醇的理想能源植物。

6 前景與展望

割手密不僅具備能源植物應有的特征,而且其根系非常的發達,可以用來固土護坡,防止水土流失,同時也是一種觀賞性比較強的禾草,具有重要的經濟價值和生態價值,應更廣范圍的收集野生割手密資源,建立全國性的割手密種質資源圃,在弄清其遺傳規律的基礎上加快開發利用。

目前,我國對野生割手密種質材料或居群的遺傳多樣性的報道大多體現在同工酶方面,利用分子標記對其遺傳多樣性的報道還很少,應當加快利用多種分子標記技術評價其遺傳多樣性的步伐。割手密育種手段比較單一,普遍采用的是有性雜交育種,但這個過程受其開花和自然條件、人為選擇多因素制約,周期長,效率不高,應結合物理、化學誘變育種以及生物技術育種等多種育種方式培育出符合經濟建設和生產需要的優良品種。國內外對割手密的研究主要集中在利用其優異基因對栽培甘蔗的遺傳改良上,對其以生物質能源研究為目的的報道尚少。從能源和環保的角度出發,割手密是具有巨大潛力的綠色能源植物。為此,應充分利用分布范圍較廣的野生割手密資源,利用其遺傳多樣性和雜種優勢篩選出具有高生物產量、高酒精產率的割手密新品系,進一步拓展能源研究新途徑。

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