花椰菜游離小孢子培養研究進展

李念祖，湯青林，王志敏，宋明

（西南大學園藝園林學院；南方山地園藝學教育部重點實驗室；重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶，400715）

花椰菜游離小孢子培養研究進展

李念祖，湯青林，王志敏，宋明

（西南大學園藝園林學院；南方山地園藝學教育部重點實驗室；重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶，400715）

分析了影響花椰菜游離小孢子培養的主要因素（材料基因型、小孢子發育時期、預處理和預培養、培養基成分、培養技術），并對胚狀體發生與植株再生、DH純系獲得等的研究情況進行了闡述，展望了游離小孢子培養技術發展前景。

花椰菜；游離小孢子；培養條件

花椰菜 （Brassica oleraceaL.var.botrytis）又稱花菜、菜花、椰菜花，是十字花科蕓薹屬甘藍種以花球為主要產品的一個變種。它富含多種維生素和微量元素，具有較高的食用價值，在我國蔬菜生產中占有重要地位。常規育種技術純化種質資源效率低、周期長，而游離小孢子培養（isolated microspore culture，IMC）技術又叫花粉培養（pollen culture），是指直接從花蕾或花藥中游離出合適的小孢子群體，在液體培養基中誘導形成小孢子胚和再生植株的過程。該技術是在單細胞水平上獲得雙單倍體（doubled haploid，DH）純系的方法，主要包括小孢子胚的誘導、再生植株和DH系形成3個過程。游離小孢子培養技術是一種有效的生物技術育種方法，可在1～2 a內獲得優良自交系和自交不親和系，用于育種可縮短育種年限，從而提高育種效率，與常規多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩定等特點。

1 小孢子胚的誘導

1.1 基因型的選擇

基因型是影響小孢子胚胎發生率的關鍵因素。不同基因型材料在相同試驗條件下培養，胚狀體產量不同。方淑桂等[1]以80份早中熟花椰菜栽培種為材料進行小孢子培養時，有20份材料誘導出胚狀體，誘導率為25%；基因型不同，產胚量差異也較大，在能出胚的基因型中，產胚量最高每蕾平均36.0個，最低的每蕾只有0.2個，相差182.5倍。趙前程等[2]的186個試材中，有55個材料得到了小孢子胚，培養反應率為29.6%。由此可見，小孢子胚胎發生能力同其他遺傳性狀一樣，是受基因調控的遺傳特性，對較難誘導的基因型，可通過與易誘導材料雜交后再培養，提高胚誘導率。

1.2 小孢子的發育時期

花蕾大小，即小孢子所處的發育時期，是影響培養效果的關鍵因素之一。植株發育狀態直接影響小孢子的生理生化特性和小孢子的發育方向，通常認為小孢子培養的最佳時期是單核晚期至雙核早期。趙前程等[2]在試驗中以單核早期、單核靠邊期、雙核期和三核期的小孢子進行培養，研究不同發育階段對小孢子胚狀體發生的影響，結果表明，單核靠邊期到雙核期的小孢子培養出胚率高，而在三核期和單核早期進行花椰菜小孢子培養不能獲得胚狀體。這與方淑桂等[1]的研究結果一致，盛花前期培養的小孢子產胚量最高，比其他時期培養的高20%以上，差異達極顯著水平。

1.3 預處理和預培養

為了提高花粉培養的效率，通常對試驗材料進行預處理。預處理包括高溫、離心、低溫、射線、甘露醇或預培養等方式，其目的就是從生理生化上改變細胞生理狀態、分裂方式和發育途徑，有效地抑制小孢子的配子體發育途徑，提高單核小孢子核對稱分裂的頻率。顧宏輝等[3]的研究結果表明，不同的熱激溫度與熱激時間組合對花椰菜小孢子培養胚產量有顯著的影響，32℃熱激處理24 h，小孢子胚產量顯著高于其他組合，這與Dias[4]發表的結論相一致，而Duijs等[5]研究卻發現30℃處理48 h最合適，方淑桂等[1]研究認為33℃處理48 h最適宜。

1.4 培養基成分

①蔗糖的濃度 蔗糖不僅作為碳源為游離小孢子提供能量并且還是小孢子的滲透調節劑，其濃度大小對小孢子存活及是否發育成胚具有很大的影響。張曉芬等[6]在研究花椰菜游離小孢子培養時，比較了含10%，13%和16%蔗糖的培養基的出胚率，結果顯示含13%蔗糖的NLN培養基胚胎發生率最高。

②激素的影響 在培養基中添加6-BA，NAA對游離小孢子培養的影響已經有很多研究。在趙前程等[7]的研究中，當1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA組合使用時，愈傷組織發育速度較快，愈傷組織質量最好，能夠進一步誘導獲得胚芽。而6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L的激素組合最適宜花椰菜胚胎愈傷組織分化形成再生植株，愈傷組織分化率達到100%，平均每塊愈傷組織的胚芽分化數量達到6.52個。

③活性炭的影響 孫丹等[8]研究表明，在培養基中添加0.10 mg/L活性炭能增加大多數品種的胚產量。原因可能是適量的活性炭可以吸附一些由于胚胎滋生產生的代謝物質，從而促進胚胎發育。趙前程等[7]對花椰菜小孢子的研究表明，在胚胎轉移到脫分化培養基的初期，添加100 mg/L的活性炭可以減少胚胎褐化、死亡，這個結果與姜鳳英等[9]的研究結果相一致。試驗中還發現，活性炭添加在固體培養基表面比混合在培養基中效果更好。韓陽等[10]研究發現，高濃度的活性炭對小孢子胚的發生表現出抑制作用。原因可能在于活動炭的吸附作用無選擇性，當其濃度超過適宜濃度后，在吸附培養基中有害物質的同時，也吸附了生長調節劑、鐵鹽、維生素等與胚生長和分化密切相關的有益物質。

1.5 接種密度的影響

接種密度是影響小孢子培養能否成功的一個至關重要的因素，也是在試驗操作中常常被忽略的問題。每1 mL培養基接種1.5～2個花蕾的小孢子較適宜，多數研究者采用每1 mL培養基接種2個花蕾的小孢子，若每1 mL培養基接種2個以上花蕾，其產胚率下降，甚至不能形成胚狀體[11]。因為小孢子濃度過高時，會消耗大量的營養物質，并且釋放許多有害物質，影響胚的發育。但小孢子發育需要群體效應，濃度過低同樣不利于小孢子胚胎的生長發育。趙前程等[7]對花椰菜小孢子培養時，小孢子培養密度為1×105～2×105個/mL時，出胚率較高。因為適宜培養的花蕾數目，可能與操作方法有關，所以應該利用血球計數板觀測并計算出較為準確的小孢子密度。

1.6 更換培養液

在小孢子培養初期更新培養液能夠提高胚狀體產量，從而減少愈傷狀胚的形成，但更換培養液需要重新離心，對正在膨大和分裂的小孢子有一定的損害。此外培養初期將高糖濃度換成低糖濃度能夠顯著提高小孢子培養的產胚率。另外，加液培養也能提高胚狀體誘導頻率，因為加液培養能夠稀釋細胞毒素，同時還能補充營養物質。顧宏輝等[3]對冬性花椰菜進行小孢子培養，結果表明，更換培養液，即在NLN-13起始培養液下培養24 h后，換成新鮮的NLN-13培養液，或將NLN-17換成NLN-10，均能明顯改善胚體形狀，減少愈傷狀胚的數量，從而提高正常胚體率。方淑佳等[1]對花椰菜進行小孢子培養時，為了維持小孢子的活力，起始培養用含16%蔗糖的培養液，3 d后加入等量的含10%蔗糖的培養液，使蔗糖質量分數稀釋到13%，出胚率與13%蔗糖的培養液對照相比增長205.08%。

1.7 振蕩培養

一般液體培養基的營養物質容易被小孢子吸收，但由于透氣不良，會有褐色胚產生。小孢子在培養14 d后，由靜置培養改為60 r/min振蕩培養，可以改善液體培養基的通氣性，使子葉胚率大大提高，胚也更健壯，提高了胚發育的同步性和胚質量，促使了胚在成苗培養基上直接成苗[9]。

2 胚狀體的發生及植株再生

小孢子分離后，經過高溫熱擊和常溫培養，約30 d可得到子葉期胚狀體；胚狀體經過誘導、萌發和繼代培養，5～6周可獲得再生植株；然后進入繼代（增殖）階段，待室外條件適宜再生植株移栽時，室外煉苗約1周后，將再生植株移入穴盤中。顧宏輝等[12]試驗結果表明，不同花椰菜品種對小孢子培養的反應不同。胚狀體產量最高的品種平均每花蕾胚產量達45.6個，最高每花蕾胚產量達到112個，而早花45 d小孢子未能誘導出胚。胚狀體對萌發培養基的反應也不盡相同。胚狀體生育期、數量、大小均對萌發率有影響。再生植株的生成還受到培養基水分、通氣、光照、溫度的影響。劉凡等[13]研究發現，成熟的小孢子胚在NLN（13%）液體培養基中停留時間的長短對以后的胚培養影響甚大，在液體培養基中停留14 d和21d的小孢子胚轉移至MS0培養基培養56 d時成苗率分別為85%和81.6%，停留28 d和35 d的小孢子胚最終成苗率只有63.3%和42.7%。周偉軍等[14]發現，胚狀體轉移到固體培養基后立即進行低溫誘導（2℃）處理10 d，其萌發率和成苗率均顯著高于無低溫處理。

3 DH純系獲得

DH純系獲得包括小孢子植株的加倍和DH后代的性狀鑒定等。研究發現，同一小孢子來源的個體，其性狀、花期等高度一致，在遺傳上是純合的；不同小孢子來源的植株后代，其性狀、花期、株高、分枝數等均有差異，出現親和、不親和等不同變異類型，可進行選擇利用。小孢子再生株后代自交結實正常，單株種子量在2 g以上，倍性穩定，可直接用于品種選育。小孢子植株有單倍體、二倍體及多倍體等類型，植株自然加倍率為60%～70%，有利于形成DH株系，在育種中具有重要意義。如需人工加倍，主要用0.2～4.0 mg/L秋水仙堿處理單倍體植株[15]。

4 展望

經過國內外學者數10 a的研究探索，游離小孢子培養的技術已越來越完善，胚狀體的誘導頻率也有了顯著提高，這為游離小孢子的廣泛應用奠定了基礎。游離小孢子培養技術可大大縮短育種年限，提高育種效率，具有單細胞單倍性、群體數量多、自然分散性好、不受體細胞干擾、便于遺傳操作等優點，因此游離小孢子培養方法還可以應用于誘變和突變體篩選、基因轉化等研究，通過花粉培養建立的雙單倍體群體更是分子標記和基因圖譜的理想材料。但是還應看到，目前花椰菜游離小孢子培養在啟動機理、微觀發育機制、發育途徑等理論研究，以及與之相關的外界環境對游離小孢子生長的生理生化方面研究還十分欠缺，還沒有建立起完善高效的再生體系。所以今后應在花椰菜游離小孢子研究中，加強基因型、微觀發育調控和外界條件對花椰菜游離小孢子生長發育的研究。

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Research on Dissociated Microspore's Culture ofBrassica oleraceavar.botrytis

LI Nianzu,TANG Qinglin,WANG Zhimin,SONG Ming
(College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University/Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions,Ministry of Education/Key Laboratory of Olericulture,Chongqing 400715)

This article summarized the main factors which affect the dissociated microspore's culture ofBrassica oleracea var.botrytis(the genotype of the material,the growth period of the dissociated microspores,pretreatment and pre-cultivation,the consisting of the culture,the technology),the embryoid's occurrence,the regeneration of the plant,and also the acquirement of DH lines are related.The foreground of the dissociated microspore's culture was also prospected.

Brassica oleraceavar.botrytis;Dissociated microspore;Culture condition

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.002

國家自然科學基金（31000908），中央高校基本科研業務費專項資金（XDJK2009C124），重慶市自然科學基金（2009BB1307），西南大學博士基金（SWU110009）

李念祖（1987-），男，碩士，從事蔬菜遺傳育種與生物技術研究，E-mail：linianzu@sina.cn

宋明，通信作者，E-mail：swausongm@yahoo.com.cn

2011-03-30