大白菜游離小孢子培養技術研究進展

董彥琪，原連莊，吳濤，原讓花，肖艷

（河南新鄉市農業科學院，453003）

大白菜（Brassicacampestris ssp.pekinensis（Lour.）Olsson）是一種原產于我國的重要蔬菜作物，屬十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，在我國秋冬季蔬菜的生產與供應中居主導地位，是我國栽培面積最大、產量最高的蔬菜作物。大白菜為異花授粉植物，雜種優勢明顯，目前主要采用常規自交的方法選育雜交種親本系，此法所需年限較長，要育成純合的可利用親本需要5~7 a時間。游離小孢子培養（isolated microspore culture，IMC） 技術是一種新興的生物技術，它具有單細胞、單倍體和較高胚胎發生率及較高同步性等特點。利用游離小孢子培養技術可以迅速獲得雙單倍體（doubled haploid，DH）純合植株，進而獲得純合親本系，2~3 a便可獲得完全純合的等基因純系，大大加快了育種進程。20世紀80年代末期，日本學者Sato等[1]首次通過游離小孢子培養技術獲得了春性早熟型大白菜的小孢子胚和再生植株；20世紀90年代初期，我國許多學者開展了大白菜游離小孢子培養[2~5]。此后，國內外學者在影響大白菜小孢子胚形成因素和小孢子胚發生機制、小孢子植株再生和加倍機制及游離小孢子培養技術的實踐應用等方面做了大量有意義的探索，并取得了許多重要的研究進展。

1 影響大白菜游離小孢子胚胎發生的因素

1.1 供試材料對小孢子胚胎發生的影響

①基因型 基因型是影響小孢子胚胎發生率的關鍵性因素。基因型對大白菜小孢子胚胎發生能力的決定作用體現在2個方面：a.基因型的反應范圍。曹鳴慶等[2]、栗根義等[4]、蔣武生等[6]均認為大白菜游離小孢子胚胎發生能力較強，能成胚的基因型分別為94.12%，92.31%和87.50%；許艷輝等[7]的試驗結果則顯示大白菜游離小孢子能成胚的基因型比率較低，僅為18.92%。b.胚胎發生頻率（產胚率）的差異。許多研究結果表明，不同基因型大白菜的胚狀體發生能力有明顯差異[2，4，6~14]；四倍體大白菜植株的游離小孢子培養同樣證明基因型對小孢子胚胎的發生能力有顯著影響[15]。姜立榮等[16]的研究表明，大白菜小孢子胚胎發生能力同其他遺傳性狀一樣，是一種受基因調控的遺傳特性[16]，基因型是影響大白菜小孢子胚胎發生啟動與否的內在因素[17]。

大白菜小孢子胚胎的發生能力還與植株類型有一定的相關性。劉凡等[18]報道疊抱型大白菜的小孢子產胚率高于合抱型，早熟型的產胚率高于中、晚熟型；方淑桂等[19]報道擰抱炮彈型大白菜小孢子胚誘導率和胚產量高于疊抱頭球型。

②外部環境 供體植株生長的溫度條件是影響小孢子培養的關鍵因子。一般從發育健壯的植株上取花蕾進行培養效果較好。現蕾期植株處于較低溫度條件下，晝夜溫度為10~25℃，胚狀體產量較高[3]。日照長度對小孢子產胚量也有一定影響，長日照（14~18 h）和低溫（15~20℃）條件下的植株胚狀體發生數及植株再生率高[7]。方淑桂等[9]的研究表明，供體植株采蕾期的氣溫條件是小孢子胚胎發生的關鍵因素，采蕾前3 d的氣溫為14℃/24℃（夜/晝）時最適宜小孢子發育。因此，在無人工氣候室的情況下，宜在春季（3~4月）進行大白菜小孢子培養，以避開秋季日照短、溫度高等不利小孢子培養的環境[15]。

③生理狀況 供體植株的株齡和花序齡對大白菜小孢子胚胎發生的影響不同。申書興等[15]的研究表明，株齡對二倍體和四倍體大白菜品種的小孢子胚胎發生率影響顯著，盛花期是進行大白菜小孢子培養的適宜時期。方淑桂等[9]的研究表明，盛花期的花蕾和供體植株的營養狀況良好，有利于胚胎發生及植株再生。軒正英等[20]的研究表明，株齡對胚誘導率有一定影響，在盛花期和末花期采集花蕾進行大白菜游離小孢子培養的產胚率最高。周英等[10]的研究表明，盛花期大白菜小孢子的出胚率高于初花期和末花期，張亞麗等[13]和王秀英等[21]的研究結果與其相同，王秀英等還進一步指出下午取蕾優于上午。

1.2 孢子對小孢子胚發育的影響

①發育時期 選擇發育時期合適的花粉是提高大白菜花粉誘導頻率的重要措施。胚胎發生的激發啟動大致發生在單核中期至單核靠邊期這一短暫的發育過程中[1，16]，該時期小孢子的最大特征是有1個大的占整個細胞體積50%以上的中央液泡，細胞核被擠壓至靠近細胞壁，細胞質相對不透明，其內含有豐富的核糖體，大量的粗面內質網、線粒體、質體等隨機分布于細胞內。與二倍體植株相似，四倍體大白菜的小孢子發育時期對胚胎產率有顯著影響，單核靠邊期小孢子占多數時胚胎產量最高[15，17]。曹鳴慶等[3]研究發現，花蕾長與小孢子發育進程密切相關。當CC11基因型大白菜的花蕾長2.0~2.5 mm時，處于單核中期的小孢子占41.7%，處于單核靠邊期的小孢子占58.3%，此時小孢子胚胎產量最高。鄒金美[17]的細胞學觀察結果表明,當花蕾長為2.0~3.0 mm、花瓣與花藥長度比為1/2~4/5時，50%~70%的小孢子處于單核靠邊期，此條件最宜進行大白菜花藥和游離小孢子培養。花蕾大小還與接種材料的栽培條件有關，如在接種溫室栽培的F1代材料的花蕾長為6~7 mm時，小孢子仍處于單核晚期，但生長在大田的大白菜植株進行花藥和小孢子培養的合適花蕾長僅為2~4 mm。因此，應結合細胞學與植物學特征確定取材時間和取樣大小。

②接種濃度 接種濃度是影響小孢子培養成功與否的重要因素之一，小孢子濃度過高和過低均不利于胚的發育。濃度過高時，其會消耗大量的營養物質，并且釋放許多有害物質，影響胚的發育；小孢子發育需要群體效應，濃度過低同樣不利于小孢子胚胎的生長發育。一般認為小孢子密度為2×104~4×104個/mL最合適，而最近的研究表明，接種濃度為 1×105~2×105個/mL 最合適[22]。

1.3 培養基成分對小孢子胚胎發生的影響

①基本培養基 培養基是誘導胚胎發生的基礎，其不僅影響小孢子細胞的分裂，而且對胚狀體再生植株的過程也有重要的影響。栗根義等[5]用改良的Lichter培養液、日本學者Sato等[1]采用大量元素減半的 NLN（Nitsch and Nitsch）培養基、張鳳蘭等[8]采用BM培養基進行了大白菜游離小孢子培養。近年來，許多學者采用NLN基本培養基進行了大白菜游離小孢子培養，其培養效果較其他培養基大大提高[3，4，6，9，19~21]。 也可采用 NLN 基本培養基進行四倍體大白菜的游離小孢子培養[15]。

②蔗糖 進行大白菜游離小孢子培養時多以蔗糖作碳源。蔗糖不但能提供小孢子生長所需的能量，而且還能維持細胞的滲透壓。蔣武生等[23]比較了不加任何激素但添加不同濃度蔗糖的NLN培養基進行小白菜游離小孢子培養的效果，結果表明蔗糖濃度為13%時培養效果較好，可為大白菜游離小孢子培養提供參考。也有研究選擇10%和17%的蔗糖濃度，結果表明，高濃度的蔗糖可保持小孢子的活力，而低濃度的蔗糖能促進小孢子的分裂及發育。

③外源激素 大白菜游離小孢子培養中，外源激素對其胚的形成和植株再生的影響尚未取得一致的結果。軒正英等[20]的研究表明，在培養基中加入6-BA能明顯促進胚狀體的發生，6-BA濃度為0.05 mg/L時胚產量最高；張亞麗等[13]和付文婷等[14]的研究認為，6-BA對胚狀體的發生和發育有促進作用，6-BA的適宜濃度為0.2 mg/L；徐艷輝等[8]也報道，6-BA對大白菜的小孢子胚胎發生有一定的促進作用，最佳濃度為0.2 mg/L，但是對難成胚的基因型，6-BA的作用不大。韓陽等[24]的研究認為6-BA的最適濃度為0.4 mg/L，而NAA的濃度為0.10~1.00 mg/L時，抑制大白菜小孢子胚的發生，且濃度越高，其抑制作用越大。另外，在進行四倍體大白菜的小孢子培養時發現，6-BA濃度為0.2 mg/L、NAA濃度為0~1.0 mg/L時，大白菜小孢子胚的發生頻率均較高，但當NAA濃度高于2.0 mg/L時出現抑制作用；當NAA濃度為0.5 mg/L、6-BA濃度為0.05~0.20 mg/L時，大白菜小孢子的產胚率高，但當6-BA濃度超過0.4 mg/L時出現抑制作用[15]。

耿建峰等[11]的研究表明，6-BA和NAA對大白菜小孢子胚的誘導率影響不大，但添加濃度過大時小孢子胚的誘導率降低。蔣武生等[6]的研究表明添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的培養基對大白菜小孢子的胚胎發生具有抑制作用。韓陽等[24]研究認為，較低濃度的細胞分裂素能促進胚狀體的發生，且6-BA的作用大于ZT，ZT的最適濃度為0.2 mg/L；2，4-D對大白菜小孢子胚的形成有較強的抑制作用。

④活性炭 在培養基中加入適量的活性炭可以加快培養進程，提高大白菜小孢子胚產量、子葉形胚率及胚狀體發育的同 步性[7，15，18，25~27]，但添 加 活性炭濃度不盡一致。徐艷輝等[7]報道，0.01~0.02 g/L活性炭可明顯促進大白菜小孢子胚狀體的形成。申書興等[15，25]的研究發現，添加 0.05~0.10 g/L活性炭對二倍體及四倍體大白菜小孢子胚生率和發育的同步性均有明顯的促進作用；孫丹等[26]的研究表明，在培養基中添加0.10 g/L活性炭能增加大多數大白菜品種的小孢子胚產量，原因可能是適量的活性炭吸附了培養基中對胚產生具有毒害作用的物質。蔣武生等[27]的研究表明，0.50 g/L活性炭有利于大白菜小孢子胚的誘導和形成。劉凡等[18]的研究也發現，在培養基中添加1.40 g/L活性炭后，一些原本無胚狀體形成的大白菜材料有胚狀體形成，原本僅能形成較少胚狀體的材料產生了較多的胚狀體，但個別材料得不到胚或只能得到1至數個不能正常發育的胚；而韓陽等[24]的研究發現，高濃度的活性炭對大白菜小孢子胚的發生表現出抑制作用。

1.4 培養技術對小孢子胚胎發生的影響

①低溫（冷擊）預處理 溫度在誘導小孢子產生胚狀體培養條件中占有重要地位。培養前低溫預處理花蕾，對大白菜小孢子的胚胎發生有一定的影響。Sato等[28]報道冷擊預處理花蕾能提高大白菜小孢子胚發生率。軒正英等[20]的研究表明，花序在4℃下處理1~2 d后，大白菜小孢子的誘導率明顯提高。路翠玲等[29]也得到了同樣結果，并發現以未經低溫處理或處理時間過長的花蕾進行培養，其胚狀體的誘導率較低。耿建峰等[11]的研究表明，低溫處理花蕾0~5 d，大白菜小孢子胚的誘導率差異不大，超過5 d其胚的誘導率則明顯降低。

②高溫（熱激）預處理 當大白菜小孢子被接種到培養基上后，需用高溫啟動和誘導小孢子發育過程的改變，即從配子體發育過程轉變為孢子體發育過程。栗根義等[4，5]認為，35℃高溫預處理對大白菜游離小孢子胚狀體的誘導很重要，其作用機制可能是通過改變小孢子的發育途徑，阻止了小孢子向成熟花粉粒方向發展，促使其沿胚胎發育途徑發展，最后形成小孢子胚。

姜立榮等[16]認為，以35℃高溫誘導時，大白菜小孢子進行第1次細胞分裂的方式多種多樣，但對稱分裂方式占優勢。劉公社等[30]應用FDA和DAPI熒光顯微技術，觀察了高溫處理對大白菜小孢子培養的影響，研究結果表明，在33℃高溫下預處理24 h，然后轉入25℃條件下培養，雖然小孢子第1天的成活率急劇下降，但隨后仍保持一定水平；且膨脹后的小孢子多呈圓球形，以對稱分裂方式為主；小孢子經多次分裂可形成緊密的多細胞團，最終形成胚狀體。李菲等[31]的研究表明，大白菜小孢子主要發育途徑為B途徑，在33℃高溫下預處理24 h后，單倍體小孢子體積膨大，染色體自然加倍，激發小孢子進入孢子體發育途徑。

趙冰等[32]的研究表明，在33℃高溫下預處理24 h對增加不同基因型大白菜材料的出胚量存在明顯差別，誘導效率越高的基因型對高溫的反應越敏感，出胚量增加的也越多。蔣武生等[6]研究發現，較易誘導產生胚的基因型，33℃高溫下處理24 h對胚誘導率的效果最好，而對于難誘導產生胚的基因型在33℃高溫下處理48 h后的胚誘導率較高。劉公社等[30]認為大白菜小孢子培養的高溫預處理時間應因基因型而異，一般應在24~48 h；若以高溫誘導處理后的小孢子分裂頻率為評價指標，小孢子接受高溫處理的敏感期處于開始培養的12 h內；若以胚胎發生為評價指標，敏感期處于開始培養的24 h內。

③振蕩培養 大白菜游離小孢子培養以固體和液體培養方式為主。一般液體培養基的營養物質容易被小孢子吸收，但其透氣性較差，會導致褐色胚的產生。申書興等[25]將培養14 d的大白菜小孢子置于搖床上培養（60 r/min）7 d，結果表明，振蕩培養改善了培養基的通氣性，促進原胚迅速發育成子葉型胚，提高了子葉胚率和胚狀體發育的同步性，同時促進小孢子胚直接成苗。趙俊等[33]報道低頻振蕩（80 r/min）極大地提高出了大白菜小孢子的出胚數。

2 影響小孢子胚植株再生的因素

2.1 胚狀體發育階段

在早期的研究中，大白菜小孢子胚胎植株成苗率很低，只有5%~10%[1]。大白菜小孢子胚的植株再生受基因的影響，再生能力強的基因型易形成小孢子胚再生植株，但處于不同發育階段的同一基因型的小孢子胚的成苗率差異很大，子葉期的胚具有迅速再生成苗的能力，魚雷期的胚則較難成苗，處于球形期和心形期的胚則發育停滯。曹鳴慶等[2]的研究表明，心形期至魚雷期的胚胎移植后半數以上發育為幼苗，其中5%~10%為白化苗。韓陽等[34]研究發現，成熟的子葉形胚的成苗率可達20%；子葉已擴大的萌發胚成苗率可達90%以上；發育早期的胚較難成苗，尤其是心形胚和球形胚其成苗率均為0。

2.2 小孢子胚在液體培養基中的滯留時間

成熟的大白菜小孢子胚在NLN-13培養基中滯留的時間對其植株再生影響很大。劉凡等[18]的研究表明，將在液體培養基中滯留14 d和21 d的小孢子胚轉移至MS0固體培養基中培養56 d時，其成苗率分別達到85%和81.6%，而停留28 d和35 d的小孢子胚最終的成苗率只有63.3%和42.7%，大大低于前兩者。

2.3 固體培養基中的水分含量

許多研究表明，增加固體培養基中的瓊脂含量可降低培養基的含水量，進而提高大白菜小孢子胚狀體的再生植株率。韓陽等[34]的研究表明，大白菜小孢子胚成熟后需要較干燥的生長環境，因此及時將成熟的子葉期胚轉入相對干燥的培養環境有利于植株再生；當培養基中的瓊脂含量為1.2%時，最有利于大白菜小孢子胚成苗，再生株率為50.5%。劉凡等[35]以含瓊脂1.2%的MS0培養基處理的大白菜小孢子胚的死胚數最少，再生植株成苗率最高，達到85.8%。申書興等[25]在進行四倍體大白菜小孢子培養時發現，再生植株成苗率與培養基的水分含量有關，適宜胚狀體成苗的培養基是B5+3%蔗糖+1.2%瓊脂。據蔣武生等[23]報道，有利于大白菜小孢子胚成苗的培養基為B5+0.2 mg/L 6-BA+3%蔗糖+1%瓊脂。

2.4 活性炭

劉凡等[18]的研究還發現經活性炭處理獲得的大白菜胚狀體在光照下轉綠、萌發、成苗等方面的能力均不及未經活性炭處理的。原因可能是活性炭的吸附作用無選擇性，當其濃度超過適宜濃度后，在吸附培養基中有害物質的同時，也吸附了其中的生長調節劑、鐵鹽、維生素等與胚生長和分化密切相關的物質。因此培養基中的活性炭濃度不宜太高，否則會起負作用。

韓陽等[34]的研究表明，培養基中添加活性炭的處理比不含活性炭的成苗率高20%~122.5%，其中添加200 mg/L活性炭的培養基最有利于大白菜小孢子胚的成苗。

3 小孢子胚的繼代、生根和移栽

蔣武生等[23]的研究表明，大白菜小孢子胚在繼代培養基B5+0.20 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA上可每25~30 d繼代1次。小孢子胚再生出芽后，將高度為3~5 cm的健壯苗轉到生根培養基MS+0.10 mg/L NAA上形成完整植株，植株具4~5片葉時移入盛有田園土的營養缽中，7 d后即可生根，10~15 d后成活，成活率可達95%。付文婷等[14]的研究結果與之相似，其認為B5+0.20 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA培養基有利于大白菜小孢子胚發育成植株，1/2 MS+0.1 mg/L NAA培養基最適宜大白菜小孢子植株生根。徐艷輝等[7]研究了KT和6-BA對大白菜小孢子胚再生植株的影響，結果表明，將小孢子胚接種在MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA的固體培養基上，2個基因型的小孢子胚再生植株無性擴繁的成活率分別為82%和92.5%，繼代培養后的大白菜小孢子胚再生植株在1/2 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.1 mg/L NAA上的生根培養基上生根良好，將已生根的再生植株移到1/2壤土+1/2糞土的盆中便可生長。張亞麗等[13]的研究表明，B5培養基中附加0.10 mg/L GA3最有利于大白菜小孢子胚分化，1/2 MS培養基中附加0.10 mg/L NAA最適合大白菜小孢子胚再生植株生根。而周英等[10]的研究表明，培養基MS+0.10 mg/L NAA最適宜大白菜小孢子胚再生植株生根。

趙岫云等[36]的研究表明，大白菜小孢子胚植株再生能力的遺傳符合加性—顯性模式，即其主要受核基因控制，基因作用以加性效應為主，高植株再生能力由隱性基因控制，其狹義遺傳力為70.6%。這一研究結果為改良小孢子胚植株再生能力差的大白菜材料提供了一條有意義的途徑，即可選用小孢子胚植株再生能力強的材料與之雜交，提高后代的植株再生能力，從而獲得更多的再生植株。

4 小孢子植株的加倍技術

只有將小孢子培養所得到的再生植株的染色體加倍為二倍體，才能將其應用于育種實踐。大白菜小孢子再生植株中出現DH植株的頻率不完全相同，但頻率均較高。曹鳴慶等[3]的研究結果表明，經由小孢子培養產生的大白菜小孢子再生植株的自然加倍率在50%~70%。李菲等[31]的研究表明，大白菜小孢子胚再生植株具有較高的自然加倍率，且其與小孢子培養時的熱激誘導密切相關。張鳳蘭等[7]的研究表明，春秋兩季大白菜品種的小孢子再生植株的自然加倍率不等，多數品種在70%，其還認為由大白菜游離小孢子培養得到的再生植株有自然加倍成為二倍體的特點。這一研究結果為游離小孢子培養技術在大白菜育種工作中的有效利用提供了廣闊的前景。目前生產中主要用0.2~4.0 mg/g秋水仙堿處理再生的單倍體植株進行人工加倍。

5 問題與展望

綜上所述，游離小孢子培養這一具有重要理論意義和實踐價值的生物技術越來越受到科研工作者的重視，并已得到廣泛的應用[37~46]。但其在應用中還存在許多理論和實際問題，如在適宜條件下，通過游離小孢子培養，大多數基因型的大白菜可以獲得小孢子胚及再生植株，但也有少數基因型不能獲得小孢子胚及再生植株；且這一技術尚未達到隨意操作雄配子的程度；另外，在大白菜小孢子啟動分裂的機理、微觀發育機制、發育途徑以及與之相關的生理生化方面的理論研究還十分欠缺。

利用游離小孢子培養技術能夠在較寬的基因型范圍內以較高的胚狀體發生率獲得大白菜小孢子胚和再生植株，但還遠遠沒有達到建立起完善、高頻的大白菜小孢子再生體系的程度。小孢子再生植株具有自然加倍成為二倍體的特點，在大白菜遺傳和育種研究方面具有十分誘人的應用前景，但小孢子胚自然加倍成為二倍體的機制尚待進一步探討。

今后應加強理論研究和提高實驗技術方面的工作，建立能穩定、高效地獲得純合二倍體的游離小孢子培養體系，提高該技術在大白菜育種工作中利用的成功率和效率，并將其與傳統育種技術有機結合，使之成為常規育種的一個重要組成部分。

[1]Sato T,Nishio T,Hirai M.Plant regeneration from isolated

microspore culture of Chinese cabbage(Brassica campestris ssp.pekinensis)[J].Plant Cell Rep,1989(8):486-488.

[2]曹鳴慶，李巖，蔣濤，等.大白菜和小白菜游離小孢子培養試驗簡報[J].華北農學報，1992，7（2）：119-120.

[3]曹鳴慶，李巖，劉凡.基因型及供體植株生長環境對大白菜游離小孢子胚胎發生的影響[J].華北農學報，1993，8（4）：1-6.

[4]栗根義，高睦槍，趙秀山.大白菜游離小孢子培養[J].園藝學報，1993，20（2）：167-170.

[5]栗根義，高睦槍，趙秀山.高溫預處理對大白菜游離小孢子培養的效果（簡報）[J].實驗生物學報，1993，26（2）：165-166.

[6]蔣武生，原玉香，張曉偉，等.提高大白菜游離小孢子胚誘導率的研究[J].華北農學報，2005，20（6）：34-37.

[7]徐艷輝，馮輝，張凱.大白菜游離小孢子培養中若干因素對胚狀體誘導和植株再生影響[J].北方園藝，2001（3）：6-8.

[8]張鳳蘭，釘貫靖久，吉川宏昭.環境條件對白菜小孢子培養的影響[J].華北農學報，1994，9（l）：95-100.

[9]方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜游離小孢子培養若干因素探討[J].福建農業學報，2004，19（4）：243-246.

[10]周英，馮輝，王超楠，等.大白菜小孢子胚誘導和植株再生[J].沈陽農業大學學報，2006，37（6）：816-820.

[11]耿建峰，侯喜林，張曉偉，等.影響白菜游離小孢子培養關鍵因素分析[J].園藝學報，2007，34（1）：111-116.

[12]胡齊贊，龔亞明，韋順戀，等.大白菜花藥和游離小孢子培養比較研究[J].浙江農業學報，2007，19（5）：352-355.

[13]張亞麗，張魯剛，張華敏，等.早熟大白菜游離小孢子胚誘導及植株再生的研究[J].甘肅農業大學學報，2009，44（3）：45-49.

[14]付文婷，張魯剛，胥宇建，等.大白菜游離小孢子胚誘導及植株再生[J].西北農業學報，2010，19（3）：139-143.

[15]申書興，趙前程，劉世雄，等.四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J].園藝學報，1999，26（4）：232-237.

[16]姜立榮，劉凡，曹鳴慶.大白菜小孢子胚狀體發生早期的超微結構研究[J].電子顯微學報，1996，15（5）：395.

[17]鄒金美.大白菜花藥和游離小孢子培養技術體系的研究[D].武漢：華中農業大學，2003.

[18]劉凡，莫東發，姚磊，等.遺傳背景及活性炭對白菜小孢子胚胎發生能力的影響[J].農業生物技術學報，2001，9（3）：297-300.

[19]方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜游離小孢子培養技術研究初報[J].福建農業學報，2003，18（2）：123-126.

[20]軒正英，徐書法，馮輝，等.大白菜游離小孢子培養成胚影響因素的研究[J].遼寧農業科學，2005（2）：18-19.

[21]王秀英，巫東堂，趙軍良，等.影響大白菜游離小孢子培養因素的研究[J].中國瓜菜，2009（2）：10-12.

[22]李維薇，藺忠龍，白現廣，等.大白菜游離小孢子培養最新研究進展[J].北方園藝，2009（2）：133-135.

[23]蔣武生，原玉香，張曉偉，等.小白菜游離小孢子培養及其再生植株[J].河南農業大學學報，2005，39（4）：398-401.

[24]韓陽，葉雪凌，馮輝.大白菜小孢子培養影響因素研究[J].中國蔬菜，2006（7）：16-18.

[25]申書興，梁會芬，張成合，等.提高大白菜小孢子胚胎發生及植株獲得率的幾個因素研究[J].河北農業大學學報，1999（4）：65-68.

[26]孫丹，王濤濤，葉志彪，等.基因型和活性炭對大白菜小孢子胚胎發生的影響[J].湖北農業科學，2005（6）：73-75.

[27]蔣武生，姚秋菊，張曉偉，等.活性炭和振蕩培養對提高大白菜胚誘導率的影響[J].中國瓜菜，2008（4）：1-3.

[28]Sato S,Katoh N,Iwai S.Effect of low temperature pretreatment of buds or inflorescence on isolated microspore culture in Brassica rapa(syn.B.campestris)[J].Breeding Science,2002,52:23-26.

[30]劉公社，李巖，劉凡，等.高溫對大白菜小孢子培養的影響[J].植物學報，1995，37（2）：140-146.

[31]李菲，張淑江，章時蕃，等.大白菜游離小孢子培養胚胎發生中的加倍機制[J].園藝學報，2006，33（5）：974-978.

[32]趙冰，聞鳳英，王玉龍，等.青麻葉大白菜小孢子培養及新品種選育[J].華北農學報，2005，20（2）：26-29.

[33]趙俊，巫東堂，趙軍良，等.影響大白菜游離小孢子培養若干因素的研究[J].山西農業科學，2008，36（8）：26-28.

[34]韓陽，葉雪凌，馮輝.提高大白菜小孢子植株獲得率的研究[J].園藝學報，2005，32（6）：1 092-1 094.

[35]劉凡，李巖，姚磊，等.培養基水分狀況對大白菜小孢子胚成苗的影響[J].農業生物技術學報，1997，5（2）：131-136.

[36]趙岫云，張鳳蘭，徐家炳，等.大白菜游離小孢子胚再生植株能力的遺傳分析[J].華北農學報，2008，23（2）：122-124.

[37]栗根義，高睦槍，楊建平，等.利用游離小孢子培養技術育成豫白菜 7 號（豫園 1 號）[J].中國蔬菜，1998（4）：16-19.

[38]高睦槍，張曉偉，耿建峰，等.通過游離小孢子培養育成的優質大白菜新品種 ‘豫白菜12號’[J].園藝學報，2001，28（1）：88.

[39]耿建峰，原玉香，張曉偉，等.利用游離小孢子培養育成早熟大白菜新品種 ‘豫新5號’[J].園藝學報，2003，30（2）：249.

[40]原玉香，張曉偉，耿建峰，等.利用游離小孢子培養技術育成早熟大白菜新品種‘豫新60’[J].園藝學報，2004，31（5）：704.

[41]蔣武生，張曉偉，耿建峰，等.極早熟大白菜新品種豫新50 的選育[J].中國瓜菜，2005（4）：27-29.

[42]姚秋菊，蔣武生，原玉香，等.游離小孢子培養育成早熟大白菜新品種‘豫新 58’[J].園藝學報，2008，35（6）：929.

[43]Zhang F L,Takahata Y.Microspore mutagenesis and in vitro selection for resistance to soft rot disease in Chinese cabbage (Brassica campestris L.ssp.pekinensis)[J].Breeding Science,1999,49:161-166.

[44]Kuginuki Y,Nakamura K,Hida K I,et al.Varietal differences in embryogenic and regenerative ability in microspore culture of Chinese cabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)[J].Breeding Science,1997,47(4):341-346.

[45]Zhang F L,Takahata Y.Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops[J].Theor Appl Genet,2001,103:254-258.

[46]Zhang F L,Aoki S,Takahata Y.RAPD markers linked to microspore embryogenic ability in Brassica crops[J].Euphytica,2003,131:207-213.