N-乙酰半胱氨酸對脂多糖刺激仔豬空腸黏膜抗氧化能力的影響

張 偉 楊震國 侯永清 丁斌鷹 朱惠玲 劉玉蘭 王 蕾

腸黏膜是機體抵御病原菌和毒素的天然屏障,在細菌、病毒或內毒素等應激狀態下,機體對能量的需求大量增長,導致大量自由基產生,自由基使核酸和蛋白質氧化,并通過脂質過氧化反應損傷生物膜,破壞了腸黏膜的完整性及功能[1-2]。因此,通過營養調控途徑改善動物腸道黏膜的抗氧化能力、提高生產性能變得意義巨大?，F已證實谷胱甘肽(GSH)在機體生物抗氧化體系中發揮重要作用,它通過清除自由基維持細胞正常的結構和功能,保護組織免受氧化損傷,但外源性 GSH不能進入完整細胞內,它的胞內合成需要外源供給 GSH的前體物質[3]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)為硫醇類化合物,是天然氨基酸 L-半胱氨酸與 GSH的前體[4],NAC作為小分子物質,易于進入細胞,脫乙?；蟪蔀?GSH合成的前體,促進 GSH的合成。體內試驗發現 NAC能提高小鼠紅細胞、肝組織和肺組織中細胞內的GSH水平[5],增強組織的抗自由基能力。另外,NAC作為 L-半胱氨酸的乙?；衔?其含有活躍的—SH,具有干擾自由基生成,調節細胞代謝等活性作用,在呼吸、心血管和神經系統方面的疾病及艾滋病的臨床和試驗研究中均有廣泛應用[6]。NAC對豬的抗氧化作用仍鮮有報道。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一,進入體內可導致大量自由基產生[7],常作為模擬應激的經典模型。由此,本試驗旨在通過對仔豬多次腹膜注射 LPS建立慢性免疫應激模型,研究 NAC對豬空腸黏膜抗氧化能力的影響,探討 NAC緩解 LPS應激導致生長抑制的機理,為 NAC的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

NAC:市售醫藥級產品,純度≥99.0%。LPS:大腸桿菌血清型 055∶B5,SIGMA公司產品。

1.2 試驗動物與試驗設計

選取 18頭健康的(35±2)日齡仔豬[杜洛克 ×長白 ×大白,平均體重(11.58±0.26)kg],隨機分成 3個組(對照組、LPS組、NAC組 ),每組6個重復,每個重復 1頭豬。預試期 3 d,正試期20 d。對照組和 LPS組飼喂基礎飼糧,NAC組飼喂基礎飼糧 +0.05%NAC,在試驗第 10天、第 13天和第 20天清晨,LPS組和 NAC組仔豬按100μg/kg BW的量腹膜注射 LPS,對照組注射相應劑量的滅菌生理鹽水。第 21天清晨,即最后1次注射 LPS 24 h后,全部仔豬注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW),待完全麻醉后屠宰,取空腸黏膜,待測。

1.3 飼糧組成與飼養管理

試驗基礎飼糧為玉米 -豆粕型飼糧,參照NRC(1998)10～20 kg豬的營養需要配制,其組成及營養水平見表 1。

試驗期間豬舍保持溫度為 22～25℃。試驗豬在不銹鋼代謝籠中單體飼養,鴨嘴式飲水器自動供水,自由采食,定時清掃和消毒豬舍。

1.4 樣品采集

豬屠宰后剖開腹腔,于空腸 1/2處截取長約10 cm的腸段,用冰凍的生理鹽水清洗后,在冰盤上用玻片迅速刮取黏膜,然后轉至盛有液氮的研缽中研成粉末,分裝。迅速轉移至 -80℃冰箱凍存。

1.5 測定指標與方法

空腸黏膜氧化相關酶活性測定,包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS);空腸黏膜氧化相關產物的含量測定,包括丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O-2)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

其中,O2-含量參考譚亞男等[8]的方法,其他指標均采用試劑盒測定。GSSG和 GSH試劑盒購買于碧云天生物技術研究所,其含量采用二硫代二硝基苯甲酸法測定,步驟詳見試劑盒說明書。其余試劑盒購買于南京建成生物工程研究所,SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定,CAT活性采用紫外分光法測定,GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定,NOS和 iNOS活性采用 NOS催化 L-Arg比色法測定,MDA含量采用硫代巴比妥酸(TAB)法測定,H2O2含量采用鉬酸絡合物比色法測定,具體步驟參照試劑盒說明書。

1.6 數據分析

試驗數據采用 SPSS 13.0統計軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)和 Duncan氏法多重比較,以 P＜0.05為差異顯著性標準,結果用平均值 ±標準差表示。

2 結 果

2.1 空腸黏膜氧化相關酶活性

由表 2可知,與對照組相比,LPS組的 SOD和CAT活性分別降低了 16.03%(P＜0.01)和47.52%(P＜0.01),NOS和 iNOS活性分別提高了21.95%(P＜0.05)和 30.00%(P＜0.01);與 LPS組相比,NAC組的 CAT活性提高了 35.61%(P＜0.05),iNOS活性降低了 18.68%(P＜0.01);與對照組相比,NAC組的 CAT活性降低了 28.83%(P＜0.01),其他指標差異不顯著 (P＞0.05)。GSH-Px活性各組差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 空腸黏膜氧化相關產物的含量

由表 3可知,與對照組相比,LPS組的 MDA、H2O2、O-2含量和 GSSG/GSH分別提高了 27.81%(P＜0.05)、15.36%(P＜0.05)、89.15%(P＜0.01)和 130.69%(P＜0.01);與 LPS組相比,NAC組的 MDA、H2O2、O-2含量和 GSSG/GSH分別降低了 24.06%(P＜0.05)、11.75(P＜0.05)、32.34%(P＜0.01)和 54.08%(P＜0.01);與對照組相比,NAC組的 O-2含量升高了 27.98%(P＜0.01),其他指標差異不顯著(P＞0.05)。

表2 飼糧添加NAC對 LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關酶的影響Table 2 Effects of dietary NAC on oxidation-relevant enzymes in jejunal mucosa of LPS-challenged piglets

表3 飼糧添加 NAC對LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關產物的影響Table 3 Effects of dietary NAC on oxidation-relevant products in jejunal mucosa of LPS-challenged piglets

3 討 論

3.1 NAC對LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關酶的影響

本試驗中,LPS刺激導致仔豬空腸黏膜 SOD和CAT活性的降低,說明 LPS多次刺激導致空腸黏膜SOD和 CAT被大量消耗,空腸黏膜抗氧化酶系統受到損害,而在 LPS刺激仔豬飼糧中添加 NAC后,SOD和 CAT活性升高,說明 NAC有助于維持抗氧化酶系統的平衡,緩解 LPS應激導致的氧化應激。作者推測 NAC可能通過抑制 NADPH氧化酶活性,導致質膜 NADPH氧化酶從 NAD(P)H傳遞電子給O2的能力降低,使得 O-2生成受阻,減少了抗氧化酶 SOD和 CAT的消耗,從而緩解了 LPS導致的氧化應激。Sridharan等[12]研究發現,NAC連續 1周胃內預處理給藥,可以增加大鼠體內 SOD、CAT的活性,與本試驗結果類似。

一氧化氮(NO)作為一種信使或介質,它既有利于機體的自身免疫防御能力,又具有潛在的毒性,而 NO的作用和信使功能主要受 NOS調控[13]。NOS分為固有型(cNOS)和誘導型(iNOS),iNOS在腸黏膜中含量豐富,在缺氧或內毒素刺激后迅速被活化[14]。腸黏膜受到應激后 iNOS由非激活狀態迅速活化,產生大量的 NO,高濃度的 NO容易與體內 O-2形成氧化性更強的 ONOO-,后者可誘導脂質過氧化損傷[15]。

本試驗中,LPS刺激使空腸黏膜 NOS和 iNOS活性升高,添加 NAC后 iNOS活性顯著降低。這證實 LPS刺激可以促進 NOS和 iNOS的活化,進而可能引起 NO大量生成,對腸黏膜組織產生毒害作用,導致氧化損傷。NAC對腸黏膜氧化損傷的緩解作用可能由于 NAC抑制了 LPS刺激誘導的 iNOS表達,具體機理有待進一步研究。與此類似,巫國誼等[16]也研究發現,NAC能降低肝臟 iNOS活性,改善急性肝損傷。

3.2 NAC對 LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關產物的影響

MDA是脂質過氧化反應的一種重要分解產物,可以間接反映機體組織氧化損傷的程度[17]。而自由基主要有 O-2自由基、羥自由基、H2O2等,這些自由基是機體氧化反應中產生的有害化合物,具有強氧化性,它們的含量高低反映了組織自由基的積累程度[18]。GSSG是 GSH的氧化形式,在氧化劑作用下 GSH通過 GSH-Px氧化成 GSSG,而 GSSG通過 NADPH供氫,在谷胱甘肽還原酶的作用下又還原成 GSH,二者構成一個動態平衡,使 GSSG維持在總 GSH量的 1%～10%[19],構成有效的抗氧化系統,故可用來評估脂質過氧化損傷情況[20]。

本試驗研究發現,LPS多次刺激導致仔豬空腸黏膜 MDA、H2O2、O-2含量增多,GSSG/GSH上升,飼糧中添加 NAC后均降低,表明 LPS刺激使腸黏膜自由基或氧化產物增多,導致脂質過氧化,而NAC能降低自由基等有害產物的積累,調節氧化與還原產物的比率,抑制 LPS對腸黏膜的損害。NAC的作用可能是因為 NAC為細胞內提供—SH來源,而活性—SH具有較強的還原能力,對體內自由基具有明顯的拮抗作用;另外,NAC能將細胞外的胱氨酸還原為半胱氨酸,并可在腸黏膜細胞中轉化成GSH,進而通過 GSH發揮抗氧化作用,清除體內的自由基。田新強等[21]發現,LPS導致小鼠肝臟 GSH含量顯著降低,MDA含量顯著升高,而飼糧中添加NAC能顯著改善這種情況;劉平洋[22]研究發現飼糧中添加 GSH可顯著降低小腸黏膜 MDA含量,改善仔豬腸道的脂質過氧化損傷;喬小蓉等[23]在人血清中加入 NAC表明,GSH/GSSG顯著升高。這些都與本試驗結果類似。

抗氧化酶與氧化相關產物之間存在著緊密的聯系,如 SOD能促進 O-2分解成 O2和 H2O2,而 H2O2又能在 GSH-Px和 CAT的作用下分解成無毒害的H2O和 O2。GSSG和 GSH能在 GSH-Px的調解下相互轉化,它們之間存在典型的氧化/抗氧化的動態平衡,這可能是飼糧中添加 NAC同時影響氧化相關酶活性與產物的原因。

有研究表明,通過不同途徑改善機體的抗氧化能力,可以提高動物的生長性能[24]。胡堯等[25]也通過對仔豬血液中抗氧化指標的檢測結果說明,飼糧添加 NAC可增強仔豬機體抗氧化能力,進而緩解 LPS刺激導致的生長抑制。本次試驗中仔豬空腸黏膜中抗氧化指標的結果也說明,飼糧添加 NAC可增強仔豬機體抗氧化能力,進而緩解 LPS刺激導致的生長抑制。

4 結 論

①LPS多次刺激使仔豬腸道氧化酶激活,抑制抗氧化酶的活性,導致有害自由基產生和氧化產物增多。

②飼糧中添加 0.05%NAC能有效緩解 LPS刺激引起的負面影響,提高腸黏膜的抗氧化能力,并可能通過此途徑緩解 LPS刺激引起的生長抑制。

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