飼喂氧化魚油對新生仔豬腸道黏膜免疫應答的影響及大豆異黃酮的干預作用

黃 琳 蔣宗勇 林映才 周桂蓮 鄭春田 陳 芳

氧化應激(oxidative stress)是人類和動物范圍內極為廣泛的綜合病癥的主要原因之一,這些綜合病癥包括腸炎、腸蠕動紊亂、各種急性炎癥等。氧化應激過程中產生的大量活性氧和活性氮可通過細胞脂質過氧化、損傷 DNA分子、調節細胞凋亡相關基因等途徑誘導細胞凋亡,引起組織損傷[1]。試驗證明,氧化魚油將會引起體內產生氧化應激[2-7],同時氧化應激可導致機體免疫功能下降[8],然而腸道氧化應激與免疫應答之間的相互關系尚未完全闡明。現有研究表明氧化應激產物活性氧簇(ROS)是炎癥和免疫活化的重要信號分子[9],ROS可對腸道黏膜免疫系統造成損害。在氧化應激誘導的細胞損傷的通路中,NF-κB-iNOSNO通路是一條關鍵通路[10],搞清楚這條通路在腸道中是否存在,又是如何調控腸道中的細胞因子,這些問題正是本研究的目的所在。大豆異黃酮(soybean isoflavone,SI)是一類從大豆中提取的、具有多酚羥基結構的生物活性物質,具有抗氧化作用[11]。本研究在人工飼養條件下,通過添加外源性氧化魚油以及 SI,研究氧化應激對新生仔豬生長性能、小腸黏膜中相關酶活性的影響,旨在探討氧化應激對新生仔豬生長、小腸黏膜發育以及腸道免疫機制以及 SI對其的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用 4日齡體重為(1.9±0.1)kg的同性別杜 ×長 ×大三元雜交新生仔豬 96頭(從母豬胎次一致、產期相同的 20窩中選取),按窩別和體重隨機分成 4個組,每組 6個重復,每個重復4頭。

1.2 試驗材料

SI為廣東省農業科學院畜牧研究所研制,含量為 98.5%。魚油為精煉飼用魚油,購于廣州永興濃縮飼料有限公司,購進時放入冷庫中保存。

1.3 試驗處理及氧化應激模型的建立

試驗采用 2(新鮮和氧化魚油)×2(未添加和添加 50 mg/kg SI)雙因子隨機區組設計。試驗設計見表 1。

表1 試驗設計Table 1 Experimental design

1.4 試驗飼糧

試驗基礎飼糧根據 NRC(1998)中 3～5 kg仔豬的飼養標準配制,基礎飼糧組成及營養水平見表 1,試驗組中的氧化魚油為人工自制。對照組(Ⅰ組 )、Ⅱ組、Ⅲ組添加 Fe2+、Cu2+與 Ⅳ組的Fe2+、Cu2+達到平衡。氧化魚油的制作方法參考John等[2]并做一定的修改,按比例添加 30 mg/kg Fe2+(以 FeSO4?7H2O形式添加)、15 mg/kg Cu2+(以 CuSO4? 5H2O形式添加)、600 mg/kg H2O2和 0.3%的水,充分混合后,(60±1)℃條件下攪拌氧化,同時不間斷的通入一定流量的空氣,分不同的時間段采樣,測定魚油中的過氧化物價(POV),即油脂氧化形成的過氧化產物氧化碘化鉀成為游離碘的量。制取一定過氧化程度的氧化魚油。氧化魚油制好后放入 -20℃冷庫中凍存待用。

1.5 飼養管理

仔豬 4日齡斷奶時稱個體重,分組。每個代謝籠中飼養 4頭仔豬,通過用保溫燈和保溫墊控制各飼養籠溫度在(30±1)℃。將飼糧干料與溫開水以 1∶4兌成液態乳樣,飼喂當天配制成新鮮液態飼料,裝進特制料槽進行飼喂。每天按仔豬體重的 30%飼喂。每次飼喂后換上裝有溫開水的料槽供仔豬自由飲水,換下的料槽用溫水清洗,飼喂時間為 07:30、10:00、12:30、15:00、15:30、22:00喂至仔豬 24日齡,試驗期為 21 d。

1.6 樣品采集和指標測定

試驗仔豬于 14日齡時稱重 1次,然后于 24日齡時晚上空腹 16 h后,于次日早上個體稱重,計算各階段及全期平均日增重;記錄耗料量,計算各階段及全期料重比。取每個重復中的 2頭仔豬共 48頭進行屠宰取樣。

取十二指腸、空腸和回腸中上段約 10 cm,在4℃條件下用磷酸緩沖液(PBS)洗凈腸道內容物,用濾紙輕輕吸干,用玻片小心刮取黏膜分裝于 Eppendorf管內,-80℃保存備用。腸道黏膜總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、肌酸激酶(CK)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物公司分析試劑盒用紫外可見分光光度計(BioMate 5,Thermo Scientific,USA)測定。腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)、白細胞介素 -2(IL-2)、白細胞介素 -6(IL-6)、白細胞介素 -8(IL-8)、白細胞介素 -10(IL-10)、核因子 -κB(NF-κB)含量,誘導性一氧化氮合成酶(iNOS)、應激激活蛋白激酶(JNK)、激活蛋白 -1(AP-1)活性采用 ELISA測定,相應試劑盒購自美國 R＆D公司。

表2 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.7 數據統計分析

試驗數據采用 SAS軟件(v6.12,SAS Institute,USA)的 GLM程序進行方差分析并用 Duncan氏法進行多重比較。統計模型包括:氧化魚油效應、SI效應以及二者的互作效應。統計顯著性水平為 P＜0.05,極顯著性水平為 P＜0.01。各組試驗數據均以平均值 ±標準誤表示。

2 結 果

2.1 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬生產性能的影響

由表 3可知,魚油氧化處理對試驗 1～21 d仔豬平均日增重和 1～21 d料重比均產生顯著影響(P＜0.05),SI處理對試驗 1～21 d仔豬料重比有影響的趨勢(P=0.058)。

2.2 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬腸道黏膜抗氧化能力的影響

由表 4可知,Ⅱ組和Ⅲ組腸道黏膜 T-AOC顯著低于Ⅰ組和Ⅳ組(P＜0.05)。魚油氧化處理對CK活性略有提高(P=0.054)。SI處理顯著提高SOD活性(P＜0.05)。氧化魚油和 SI對 T-AOC產生極顯著互作效應(P＜0.01)。

2.3 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬空腸黏膜 MDA含量的影響

由表 5可知,新生仔豬飼糧魚油氧化處理極顯著提高了空腸黏膜 MDA含量(P＜0.01)。Ⅲ組仔豬腸道黏膜 MDA含量比Ⅰ組和Ⅱ組分別提高了 90.89%(P＜0.05)和 73.28%(P＜0.05)。

2.4 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬腸道黏膜免疫因子的影響

由表 6可以得出,Ⅳ組腸道黏膜 IL-10含量極顯著低于Ⅲ組(P＜0.01);Ⅲ組和Ⅳ組腸道黏膜IL-10含量極顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組(P＜0.01)。魚油氧化處理極顯著提高新生仔豬腸道黏膜 IL-2含量(P＜0.01),極顯著降低 IL-10含量 (P＜0.01),顯著降低腸道 IL-8含量(P＜0.05)。SI處理極顯著提高了腸道黏膜 IL-10的含量(P＜0.01)。氧化魚油和 SI對 IL-10含量產生極顯著互作效應(P＜0.01)。

表3 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬生產性能的影響Table 3 Effects of SI supplementation on the performance of neonatal piglets fed fresh and oxidized fish oil diets

表4 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬空腸黏膜抗氧化能力的影響Table 4 Effects of SI supplementation on the ability of antioxidation in jejunum mucosa of neonatal piglets fed fresh and oxidized fish oil diets

表5 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬空腸黏膜 MDA含量的影響Table 5 Effects of SI supplementation on the content of MDA in jejunum mucosa of neonatal piglets fed oxidized and fresh fish oil diets

表6 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加SI對新生仔豬空腸黏膜細胞免疫因子的影響Table 6 Effects of SI supplementation on the cell-mediated immunologic factors of jejunum mucosa in neonatal piglets fed fresh and oxidized fish oil diets

2.5 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對新生仔豬腸道黏膜免疫和氧化相關因子的影響

由表 7可以得出,Ⅲ組對新生仔豬腸道黏膜NF-κB含量的影響極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01),顯著高于Ⅳ組(P＜0.05)。魚油氧化處理顯著提高了腸道黏膜 iNOS活性(P＜0.05),對 NF-κB含量略有升高(P=0.08)。氧化魚油和 SI對腸道黏膜NF-κB含量產生顯著互作效應(P＜0.01),對 AP-1含量略有互作效應(P=0.098)。

3 討 論

研究表明給試驗動物飼喂氧化魚油可使動物機體 ROS大量產生,MDA含量增加,體內 T-SOD降低,誘導氧化應激[2-7]。本試驗給新生仔豬飼糧中添加氧化魚油,建立新生仔豬腸道氧化應激模型,從試驗結果中得出,飼糧中添加氧化魚油對新生仔豬腸道 T-SOD、CK活性、T-AOC以及 MDA含量有顯著變化,這說明本試驗添加氧化魚油組成功建立了新生仔豬腸道氧化應激模型。SI可抑制自由基的產生和清除自由基,可誘導增強內源抗氧化酶活性,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、CAT等,可增加金屬硫蛋白 (MT)的合成。SI的抗氧化作用已引起了國內外學者的廣泛關注[12-17]。本試驗結果表明,給人工飼養的 4日齡斷奶仔豬代乳料中添加氧化魚油后,飼喂 SI表現出不同的生長速度,在氧化應激情況下,飼糧添加 SI仔豬料重比和無應激下飼喂基礎飼糧仔豬的料重比相比較,飼糧添加 SI有補償仔豬飼喂氧化魚油后引起的生長不良反應。

表7 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加SI對新生仔豬腸道氧化相關因子和黏膜免疫的影響Table 7 Effects of SI supplementation on the Co-oxidation and immune-related factors of jejunum mucosa in neonatal piglets fed oxidized and fresh fish oil diets

IL-10具有抗炎和抑制多種細胞因子合成的作用,主要抑制 Th1細胞的激活和細胞因子的產生,其生物學功能主要是抑制和終止炎癥反應,并且IL-10具有很強的抑制巨噬細胞活性的作用[18],有研究表明長期的高脂膳食可導致機體形成亞臨床狀態的炎癥狀態,這種低度的炎性狀態與代謝綜合癥有密切的關系[19]。Deng等[8]的研究表明,對斷奶仔豬用注射敵草快誘導氧化應激模型后,仔豬血液中白細胞介素 -1(IL-1)和干擾素 -γ(IFN-γ)增加,說明機體免疫功能發生改變。在本實驗中,飼喂氧化魚油組仔豬腸道黏膜中 IL-2水平顯著增高,IL-8和 IL-10下降,證明了氧化魚油誘導的腸道氧化應激導致了炎癥反應,使動物的免疫機制發生改變。

NF-κB是由 NF-κB/Rel蛋白家族的 2個亞基組成的二聚體蛋白質,幾乎存在于所有細胞中在正常情況下,細胞內的核轉錄因子 κB結合成復合物,當細胞受到自由基作用,在氧化應激狀態下,NF-κB從復合體中解離并向核內移動,與位于核內的基因序列上特異性調控區結合,從而激活受調控的基因表達[20]。因此,測定 NF-κB在細胞中的變化,可反映出細胞在自由基作用的程度。本研究中,與炎癥反應相關的 2個基因表達水平升高,其中 NF-κB表達水平顯著上調,說明氧化魚油誘導的腸道氧化應激可使機體生成過多的 ROS,ROS可通過激活氧化還原狀態敏感的轉錄因子 NF-κB來促進前炎性細胞因子的表達,加劇炎癥反應。本試驗研究結果表明,SI可下調 NF-κB的表達水平,說明 SI能通過清除過多的自由基來恢復機體氧化還原狀態。從本試驗的研究中還可以得出腸道氧化應激誘導細胞損傷通路是通過 NF-κB-iNOS-NO進行的。

4 結 論

給新生仔豬飼喂氧化魚油飼糧造成了仔豬腸道氧化應激,誘發了腸道炎癥反應,添加 SI能在一定程度上改善飼喂氧化魚油誘導的氧化應激狀態,從而緩解炎癥的發生,增強機體的抗氧化能力。

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